1.評價指標(biāo)體系

1）心電圖：以“ST段抬高”作為心肌缺血的一個評價指標(biāo)。當(dāng)心肌缺血是，ST段抬高，而滴加細(xì)顆粒物能夠?qū)е耂T段抬高更為顯著，且持續(xù)時間較長。

2）心臟超聲：評價左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）和主動脈流出道血流（AV Peak Vel），當(dāng)上述值降低時，說明左心室功能障礙。

3）心臟TTC染色：TTC 染液能與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色，缺血組織內(nèi)呈蒼白色。

4）心肺組織病理HE染色：通過心肺組織病理染色，觀察心肺組織病理性改變和組織結(jié)構(gòu)性改變。

5）心肌損傷標(biāo)記物：當(dāng)心肌損傷時心肌損傷標(biāo)記物：cTnT、CK-MB、LDH顯著升高。

6）血清炎癥因子：檢測血清中炎癥因子：IL-6、TNF-α、MCP-1等炎癥因子，當(dāng)心肌損傷時而導(dǎo)致炎癥因子增加，而滴注細(xì)顆粒物后顯著增加炎癥因子水平。

2. 國內(nèi)外現(xiàn)有模型的異同

目前對于在研究細(xì)顆粒物致心血管損傷研究中，Hongyun Wang等通過將雄性C57BL/6J小鼠長期暴露于空氣收集的PM2.5（12小時/天，每周7天，6個月）染毒，成功構(gòu)建PM2.5誘發(fā)的心肺損傷模型。Chenxu Ge等同樣采用長期暴露（6小時/天，每周5天，6個月）成功構(gòu)建PM2.5誘發(fā)的心肺損傷模型。Zenghua Qi等人則將C57BL/6J小鼠直接長期飼養(yǎng)暴露于PM2.5中6個月，從而成功構(gòu)建PM2.5導(dǎo)致的心功能障礙模型。Siqi Wang等人基于ApoE?/?小鼠，通過高脂喂養(yǎng)合并PM2.5氣管滴注（每周1次，共8周），成功構(gòu)建PM2.5加重動脈粥樣硬化模型。Jun-Jiang Chen等人通過主動脈縮窄術(shù)首先構(gòu)建慢性缺血模型，造模成功后將缺血小鼠暴露在PM2.5濃縮暴露裝置中（6小時/天，5天/周，8周）。可見與單純長期暴露，復(fù)合模型能夠縮短造模周期和染毒時間，同時該模型也更符合臨床病理發(fā)展進程。

3. 技術(shù)難點

（1）手術(shù)難度：本實驗室采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支構(gòu)建心肌缺血模型，該手術(shù)需要開胸，氣管插管連接呼吸機，還需要在體式顯微鏡下進行操作，具有很大的難度，對操作人員具有很高的要求。

（2）氣管插管：該模型需要多次進行氣管滴注，需要采用非暴露式插管進行染毒。

（3）動物成活率和成模率：本實驗采用兩種因素復(fù)合造模，若操作不熟練將會導(dǎo)致死亡率過高，且成模率過低，導(dǎo)致實施難度大

4. 創(chuàng)新性

（1）采用兩種復(fù)合因素造模，更好的模擬疾病的病理進程

（2）采用細(xì)顆粒物標(biāo)準(zhǔn)品進行染毒，實現(xiàn)通過增強毒力縮短了造模時間。

5. 應(yīng)用價值

采用氣管滴注復(fù)合心肌缺血造模，能很好地模擬細(xì)顆粒物加重心血管疾病的疾病環(huán)節(jié)。因此，該模型為研究細(xì)顆粒物導(dǎo)致心血管疾病機制研究以及藥效學(xué)研究提供了一個已操作、穩(wěn)定可控的動物模型。

動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所的屏障環(huán)境，12 h 照明/12 h 黑暗( 照明: 8: 00-20:00) ，飼養(yǎng)期間給予動物標(biāo)準(zhǔn)飼料和潔凈飲水。本動物實驗遵守國際實驗動物倫理學(xué)要求。

3.1心肌缺血手術(shù)過程及二導(dǎo)聯(lián)心電圖檢測小鼠心肌缺血時ST段的抬高及DPM 暴露后的影響

結(jié)扎冠狀動脈左前降支成功建立小鼠心肌缺血模型。臨床檢測顯示ST段抬高，往往預(yù)示著存在急性心肌缺血，甚至心肌梗死，因此本研究選用ST段是否抬高作為評價心肌缺血模型的指標(biāo)之一。結(jié)果顯示：MI 組小鼠 ST 段顯著升高。

MI+DPM復(fù)合組ST段升高更為顯著，且呈弓背向上抬高，且持續(xù)抬高時間較長。

圖1 DPM 暴露對心肌缺血時 ST 段的影響（n=12）

Figure 1 Effect of DPM on ST segment of Myocardial ischemia

3.2細(xì)顆粒物對心肌缺血小鼠左心室結(jié)構(gòu)相關(guān)功能的影響

通過小動物超聲檢測左心室相關(guān)指標(biāo)：左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左室短軸縮短率（LVFS），結(jié)果如圖2所示：與 Sham 組相比，MI 組小鼠LVEF和LVFS顯著降低（P<0.01）；與 MI 組相比，MI+DPM 組LVEF和LVFS持續(xù)下降（P<0.01）。

圖2 DPM 暴露對小鼠心肌缺血后心室結(jié)構(gòu)及功能的影響

Figure 2 Effects of DPM exposure on left ventricular systolic function after myocardial ischemia in mice（n＝12，Mean ± SEM），與Sham組相比，**P＜0.01；與MI組相比，#P＜0.05；##P＜0.01

3.3細(xì)顆粒物對心肌缺血小鼠主動脈流出道血流的影響

術(shù)后 24 h 后利用小動物超聲檢測小鼠主動脈流出道血流（AV Peak Vel），結(jié)果如下表所示：與 Sham 組相比，MI 組小鼠主動脈流出道血流顯著降低（P<0.05）;與 MI 組相比，MI+DPM 組小鼠主動脈流出道血流呈下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異

表1 DPM 暴露對小鼠心肌缺血后對主動脈流出道血流的影響（n=6）

Table 1 Effects of DPM exposure on aortic valve peak flow velocity aftermyocardial ischemia

與Sham組相比，*P＜0.05；

3.4細(xì)顆粒物對心肌缺血小鼠心肌梗死面積的影響

TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感復(fù)合物，常用于檢測組織缺血性梗塞。TTC 染液是呼吸鏈中吡啶-核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，能與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色，而缺血組織內(nèi)由于脫氫酶活性下降，不能反應(yīng)，故不能產(chǎn)生變化呈蒼白色。見圖 4-3，與假手術(shù)組（Sham）相比，心肌缺血組（MI）梗死面積顯著增大；與 MI 組相比，復(fù)合模型組（MI+DPM）心肌梗死面積增加。

圖3DPM 暴露對小鼠心肌缺血后心肌梗死面積的影響

Figure 3Effects of DPM exposure on myocardial infarctionarea after myocardial ischemia in mice（n=6，與Sham組相比，**P＜0.01）

3.5細(xì)顆粒物對心肌缺血小鼠肺組織病理變化的影響

對各組小鼠肺組織進行 HE 病理染色，結(jié)果如圖4所示，Sham 組肺泡壁

較薄，結(jié)構(gòu)完整，無充血及水腫，也無炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。較 Sham 組相比，MI組小鼠肺組織中可見肺泡壁明顯增厚，支氣管管腔結(jié)構(gòu)異常，并伴有大量嗜酸性粘液分泌，肺組織可見明顯的出血癥狀。與 MI 組相比，MI+DPM 復(fù)合模型組，出現(xiàn)了肺泡壁的斷裂，支氣管管腔的嗜酸性粘液分泌增多和黑色顆粒物積現(xiàn)象，其余癥狀與 MI 組相比無明顯差異。

圖4 DPM暴露對小鼠心肌缺血后對肺組織病理變化的影響（X400）

Figure 4Effects of DPM exposureon pathological changes of lung tissue after myocardial ischemia in mice

3.6 細(xì)顆粒物對心肌缺血小鼠心肌組織病理變化的影響

心肌組織病理結(jié)果如下圖5所示：Sham組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)完整，心肌纖維排列規(guī)則整齊，橫紋清晰，染色均勻，細(xì)胞組織間無明顯炎癥細(xì)胞浸潤，無組織壞死；與Sham組相比，MI組小鼠心肌纖維部分區(qū)域排列不規(guī)則，可見心肌纖維化，細(xì)胞腫大并伴有空泡，胞質(zhì)染色不均勻，細(xì)胞間質(zhì)有炎癥細(xì)胞浸潤，少量心肌纖維呈點狀壞死，可見胞質(zhì)淡染，核固縮、破裂或溶解消失；與MI相比，MI+DPM組心肌細(xì)胞腫脹伴有空泡，可見局灶性組織細(xì)胞壞死，局部可見結(jié)締組織增生，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤。

圖5 DPM暴露對小鼠心肌缺血后對心肌組織病理變化的影響()

Figure 5 Effects of DPM exposure on pathological changes of lung tissue after myocardial ischemia in mice

3.7細(xì)顆粒物對心肌缺血小鼠血清心肌損傷標(biāo)記物影響

結(jié)果如圖6所示，與Sham組相比，MI組小鼠血清中的LDH明顯升高（P<0.0001）；與MI相比，MI+DPM組能夠升高血清中LDH的含量（P<0.0001）；與Sham組相比，MI組血清中cTnT和CK-MB無明顯變化；與MI相比，MI+DPM組小鼠血清中cTnT，CK-MB含量急劇升高（P<0.001；P<0.05）。

圖6 DPM暴露對小鼠血清心肌損傷標(biāo)記物L(fēng)DH，cTnT，CK-MB的影響

Figure 6 Effects of DPM exposure on LDH and cTnT in serum

注：與Sham組比較，****P＜0.0001；與MI組比較， #P＜0.05； ###P＜0.001； ####P＜0.0001

3.8 細(xì)顆粒物對心肌缺血小鼠血清中炎癥因子表達(dá)水平的影響

結(jié)果如圖7所示：與Sham組相比，MI組小鼠血清IL-6含量顯著升高（P<0.0001）；與MI組相比，MI+DPM組IL-6含量同樣顯著升高（P<0.0001）；

MI組血清中TNF-α與Sham組含量相比有輕微升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異；與MI相比，復(fù)合模型組MI+DPM 中TNF-α含量明顯升高（P<0.0001），與Sham組相比，MI組小鼠血清中MCP-1的含量急劇升高（P<0.0001）；與MI組相比，MI+DPM組含量水平下降（P<0.01）。

圖7 DPM暴露對小鼠血清炎癥指標(biāo)IL-6，TNF-α，MCP-1的表達(dá)水平的影響

Figure 7 Effects of DPM exposure on the expression levels of IL-6, TNF-α and MCP-1 in serum

注：與Sham組比較，****P＜0.0001；與MI組比較， ###P＜0.001； ####P＜0.0001

1實驗材料1.1實驗動物

選擇SPF級C57小鼠，雄性，6-8周齡，體重20-25 g，共48只；由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK（京）2016-0011。分籠飼養(yǎng)，每籠5-6只，共9籠。實驗場地由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥所動物房提供，在SPF級條件下飼養(yǎng)管理，室溫（22±1）℃，相對濕度40%-60%，12 h明暗循環(huán)照明。本研究所有動物實驗相關(guān)操作均在中國中醫(yī)科學(xué)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)下進行。

1.2實驗材料

三溴乙醇；叔戊醇；TTC染液；4%多聚甲醛；BCA蛋白定量試劑盒；RIPA裂解液（中）；無水乙醇；二甲苯；HE染液套裝；中性樹膠；IL-6、TNF-α、MCP-1試劑盒

小動物呼吸機（ALC-V8S，上海奧爾科特生物科技有限公司）；實驗用冷光源（F－150C，RWD）；小動物超聲影像系統(tǒng)（VISUALSONICS,Vevo2100）；精細(xì)手術(shù)剪和手術(shù)鑷（德國醫(yī)療器械（集團）有限公司手術(shù)器械廠）；體視顯微鏡（OlymPus N2，日本奧林帕斯公司）；1/10萬電子分析天平（BP211D德國Sartorius公司）；多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）數(shù)控超聲器（昆山市超聲儀器有限公司）；qPCR分析儀（qTower-3G；德國耶拿分析儀器股份公司）；萊卡半自動石蠟切片機（RM2245，日本萊卡公司）；萊卡全自動脫水機（AsP200S，日本萊卡公司）；小動物心電圖機（FX-8222T，北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司）；照相機（EOS-600D，Canon）；正置光學(xué)顯微鏡（Nikon EcliPse E100，日本尼康）；Multiskan MK3酶標(biāo)儀；日立7600全自動生化儀

2實驗方法2.1分組及實驗

C57雄性小鼠按體重隨機分為3組，實驗分組如下：

（1）假手術(shù)組（Sham）：0.9%生理鹽水氣管滴注1周（1 mg/mL，50 μL/次，2次/周），染毒一周后進行冠狀動脈左前降支只穿線不結(jié)扎

（2）模型組（MI）：0.9 %生理鹽水氣管滴注1周（1 mg/mL，50 μL/次，2次/周）后進行冠狀動脈左前降支結(jié)扎

（3）復(fù)合模型組（MI +DPM）：DPM混懸液氣管滴注1周（1 mg/mL，50 μL/次，2次/week）后進行冠狀動脈左前降支結(jié)扎

2.2指標(biāo)檢測2.2.1肢體二導(dǎo)聯(lián)心電圖檢測

冠狀動脈左前降支LAD結(jié)扎術(shù)前，連接肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖，記錄正常狀態(tài)下心電圖，LAD結(jié)扎后1 min內(nèi)，觀察S-T段變化，并記錄二導(dǎo)聯(lián)心電圖。LAD結(jié)扎后二導(dǎo)聯(lián)心電圖S-T段明顯抬高，即為造模成功。

2.2.2心臟超聲檢測

手術(shù)造模后24 h，采用Vevo 2100小動物超聲儀進行心臟超聲檢查。首先采用三溴乙醇對小鼠進行麻醉，接著小鼠仰臥位固定，在手術(shù)備皮處涂抹超聲耦合劑，四肢與生理監(jiān)測電極相連，監(jiān)測心率、呼吸頻率等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)并記錄心電圖變化。使用小動物超聲檢測左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction, LVEF）左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening, LVFS）和主動脈瓣最大血流速度（aortic valve Peak flow velocity, AV Peak Vel）。

2.2.3心臟組織TTC染色

將心臟灌流，洗凈多余殘血，用錫紙包裹置于-20 ℃凍存20 min，取出置于心臟模具（提前預(yù)冷）中，在結(jié)扎線下平行于冠狀溝將心臟切成2 mm厚的切片4片，用濾紙吸去多余水分后，放入預(yù)熱的TTC染液中，于37℃恒溫避光振搖染色15 min。正常心肌組織被染為紅色，梗死心肌呈淡白色，染色結(jié)束后拍照記錄。用Image J軟件進行圖像分析，測量每片的梗死面積和總面積，每層梗死體積為該層梗死面積和層厚的乘積，各層的梗死體積之和即為總的梗死體積。

2.2.4心，肺組織HE病理檢測

心肺組織蘇木精－伊紅（HE）染色

（1）取出已固定的組織，厚度約4mm，放入脫水盒中，做好標(biāo)記

（2）脫水與透明

（3） 浸潤包埋：透明的組織塊放入其中，迅速冷卻后包埋

（4） 切片、展片和烤片

（5） 石蠟切片脫蠟至水

（6） 蘇木素染色

（7） 伊紅染色

（8） 脫水封片

（9） 在光學(xué)顯微鏡下拍照存取圖像，并進行分析

2.2.5血清心肌損傷酶生化指標(biāo)檢測

于所有處理結(jié)束后24 h內(nèi)，小鼠摘眼球取血。靜置2h后，4℃，3000 rpm，離心15 min。取上清，檢測以下指標(biāo)：乳酸脫氫酶（LDH），按照試劑說明書操作，使用自動生化儀進行測定；肌紅蛋白（cTnT）采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）進行測定。

2.2.6 ELISA檢測血清炎癥指標(biāo)IL-6，TNF-α，MCP-1的表達(dá)水平

小鼠血清中IL-6、TNF-α、MCP-1含量均采用ELISA檢測試劑盒檢測，按照試劑盒說明書操作。

2.3數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SEM）表示，使用GraphPad Prism 8軟件，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA），組間差異的比較用Dunnett's Multiple Comparison檢驗；當(dāng)P< 0.05時判定兩組間具有顯著性差異。

1.目的

在醫(yī)學(xué)研究中，選擇合適的動物模型至關(guān)重要，目前已有很多公認(rèn)的心血管疾病動物模型和細(xì)顆粒物（PM）暴露動物模型。目前大多數(shù)研究主要以單疾病研究為主，但單一因素的模型不適宜去研究PM2.5加重心血管疾病的潛在機制的探究，在研究復(fù)雜疾病中有較大的局限性。當(dāng)前推薦使用復(fù)合模型可以更好地模擬實際情況，因此本模型將氣管滴注細(xì)顆粒物染毒和心肌缺血模型結(jié)合，有利于探究PM2.5增加心血管事件的潛在機制。

2. 意義

細(xì)顆粒物（fine particulate matter;PM2.5）目前作為心血管疾病一個公認(rèn)的危險因素。大量流行病學(xué)研究表明 PM2.5長期暴露能夠促進冠狀動脈鈣化灶的形成，加速動脈粥樣硬化的進程[1]；能增加高血壓發(fā)病率[2, 3]；加快糖尿病病變進程[4]。一項基于我國12萬成年人平均隨訪8年的前瞻性研究顯示，PM2.5年均暴露濃度每增加10μg/m3，冠心病風(fēng)險增加43%[5]。但目前PM2.5增加心血管事件的潛在介質(zhì)尚不完全清楚。在探索機制的過程，選擇合適的動物模型至關(guān)重要。

3. 國內(nèi)外研究進展

小鼠繁殖力強、易于飼養(yǎng)、價格低廉、占用空間少、操作簡便，品系多樣使其可根據(jù)研究目的建立復(fù)合模型，且小鼠基因在一定程度與人類基因同源性強，因此我們選擇小鼠為模型建立的對象。小鼠心肌梗死模型的制作方法有藥物法、微創(chuàng)法、電刺激法、冷凍法、冠狀動脈左前降支結(jié)扎法等，其中冠狀動脈左前降支結(jié)扎法最為經(jīng)典和常用。這種方法可直接造成左心室前降支堵塞，與臨床中的心肌梗死原理貼近，試驗周期短，可以觀察梗死后對心肌的損害。

細(xì)顆粒物體內(nèi)毒性作用研究實驗中，常用的三種染毒方式為氣管滴注染毒、尾靜脈注射染毒和全身自由暴露法染毒。其中全身自由暴露染毒對暴露設(shè)施儀器有較高要求，實施難度較大，尾靜脈注射染毒不能夠完全模擬細(xì)顆粒物經(jīng)氣道進入人體的過程，因此與事實最相符、最常用的方法是氣管滴注染毒。

目前對于在研究細(xì)顆粒物致心血管損傷研究中，Hongyun Wang[6]等通過將雄性C57BL/6J小鼠長期暴露于空氣收集的PM2.5（12小時/天，每周7天，6個月）染毒，成功構(gòu)建PM2.5誘發(fā)的心肺損傷模型。Chenxu Ge[7]等同樣采用長期暴露（6小時/天，每周5天，6個月）成功構(gòu)建PM2.5誘發(fā)的心肺損傷模型。Zenghua Qi[8]等人則將C57BL/6J小鼠直接長期飼養(yǎng)暴露于PM2.5中6個月，從而成功構(gòu)建PM2.5導(dǎo)致的心功能障礙模型。Siqi Wang[9]等人基于ApoE?/?小鼠，通過高脂喂養(yǎng)合并PM2.5氣管滴注（每周1次，共8周），成功構(gòu)建PM2.5加重動脈粥樣硬化模型。Jun-Jiang Chen[10]等人通過主動脈縮窄術(shù)首先構(gòu)建慢性缺血模型，造模成功后將缺血小鼠暴露在PM2.5濃縮暴露裝置中（6小時/天，5天/周，8周）。可見與單純長期暴露，復(fù)合模型能夠縮短造模周期和染毒時間，同時該模型也更符合臨床病理發(fā)展進程。

本研究團隊綜合了本實驗室具體情況，在沒有全身暴露裝置以及縮短造模時長前提下優(yōu)化造模方式，選擇了細(xì)顆粒物標(biāo)準(zhǔn)品為染毒物品，該標(biāo)準(zhǔn)品來源于柴油顆粒物，主要由多環(huán)芳烴(PAHs)和硝基取代的多環(huán)芳烴(硝基-PAHs)組成。PAHs是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的一類持久性有機污染物，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可在大氣、水體、沉積物、灰塵等多種環(huán)境介質(zhì)中長期存在，具有半揮發(fā)性特性，由環(huán)境中各種燃料的不完全燃燒產(chǎn)生。多環(huán)芳烴中的代表苯并（a）芘，具有強致癌作用。因此本方法采用毒性更強，物質(zhì)更確定的細(xì)顆粒物標(biāo)準(zhǔn)品混懸液進行氣管滴注，既能解決實驗設(shè)施弊端，又能縮短造模周期。

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