霧化吸入LPS致肺炎大鼠模型
討論與結論
1.評價指標體系
該模型是采用霧化吸入LPS誘導的大鼠肺炎模型，通過肺組織病理學、肺灌洗液的白細胞計數以及肺組織的炎性因子（IL-1β、IL-6以及TNF-α）對于該模型進行評價。
2. 國內外現有模型的異同
相比于現有模型，在造模方法上與現有模型有不同：在造模方式上采用霧化吸入給予LPS的方式，檢測指標與現有模型基本一致包括：肺組織病理學、灌洗液白細胞計數以及肺組織炎癥因子。霧化給藥過程中LPS藥液的濃度固定，對霧化粒徑以及霧化后氣溶膠的濃度進行監測能夠保證造模能夠有很好的重復性以及較高的成功率。
3. 技術難點
對霧化用的LPS藥液霧化粒徑以及霧化濃度的監測保證模型的一致性以及可重復性。
4. 創新性
在造模方式上采用霧化吸入的給藥方式，同時在給藥過程中確定霧化液濃度，對于霧化粒徑（中位粒徑在3μm左右）保證藥液能夠吸入到肺部，霧化用LPS液體濃度固定，同時對于霧化后氣溶膠的濃度進行監測這樣能夠保證模型的一致和可重復性。該給藥方式為局部吸入給藥，相對于目前的全身給藥（尾靜脈和腹腔）能夠減少全身的不良反應。對于吸入和氣管局部注射吸入給藥該給藥方法操作簡單，動物成模率高，肺部病變均勻模型穩定可重復性高。
5. 應用價值
采用霧化LPS方法誘導的肺炎模型相較于目前腹腔及尾靜脈注射給藥和氣管注射給藥等給藥方式具有模型穩定、肺部組織損傷均勻一致，全身作用小等優點，本研究方法更加科學，是對現有LPS誘導模型較好的優化和提升。因此，該模型為藥物的篩選、藥效評價及可能的機制探索提供了一個穩定可靠的動物模型。
生物安全性
實驗動物采用SPF級大鼠，動物飼養于中國中醫科學院中藥研究所和平里園區實驗動物房，屏障系統豚鼠房飼養，實驗設施許可證SYXK（京）2019-0003。飼養期間給予動物標準飼料和潔凈飲水。本動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。
評價驗證
1材料與方法
1.1材料
1.1.1藥品及試劑
脂多糖(LPS)：sigma公司生產，批號：127M4030V。地塞米松磷酸鈉注射液：貴州天地藥業有限責任公司生產，批號：19110802A。三氯乙醛水合物：上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10636049。甲醛：福晨（天津）化學試劑有限公司生產，批號：20190920。生理鹽水：石家莊四藥有限公司生產，批號：2006192110。
1.1.2儀器
口鼻暴露吸入塔：Melton Inhalogic NIES 口鼻式吸入暴露系統，eppendorf離心機，型號centrifuge 5810R；電子天平：德國Sartorius公司生產，型號；BSA3202S-CW型；顯微鏡及圖像分析系統：日本olympus公司生產，型號；BX51；霧化器：PARI Turbo BOY N霧化器；CEL-712 Microdust Pro監測儀；Spraytec實時噴霧粒度分析儀，英國馬爾文公司。
1.2方法
Wistar大鼠，170 ~190g，雄性，適應性喂養5天，根據體重隨機分為3組，空白組、模型組、陽性組，每組10只。將CEL-712 Microdust Pro監測儀插入到Melton Inhalogic NIES口鼻式吸入暴露系統的暴露孔，對霧化氣溶膠進行濃度進行監測。將動物裝于口鼻暴露霧化腔體，在霧化器中裝入4 mg/mL的LPS溶液，口鼻暴露系統與霧化裝置連接，霧化吸入給與大鼠LPS溶液(LPS霧化中位粒徑3um左右)15 min進行造模，每次霧化藥液體積約為5mL，連續三天，第四天早上即第三次造模后16 h各組進行取材。
樣本采集：造模后16 h用10%的水合氯醛麻醉（0.35 mL/100g），腹主動脈采血，暴露胸腔，右葉結扎，用生理鹽水灌洗左肺，緩緩打入，靜止平衡30 s，緩緩抽出，1 mL/次，灌洗2次，灌洗速度2 mL/min（30 s/次），合并灌洗液（回收率＞60%）。Wright-Giemsa染色法觀察肺泡灌洗液中炎癥細胞（巨噬細胞、中性粒細胞）含量。右肺用4%甲醛固定，室溫保存，待進一步病理檢測，制備石蠟切片供組織學檢查。
觀察指標：①肺組織病理形態學檢查：將肺組織進行包埋、切片以及HE染色制備成肺組織病理切片，在光學顯微鏡下進行觀察，進行肺組織病理損傷評分。②肺泡灌洗液中性粒細胞計數：肺泡灌洗液離心，將重懸后的肺泡灌洗液稀釋，制成均勻的細胞懸液，取10 μL加至細胞計數板上，靜止3 min，待細胞完全沉淀后，在低倍鏡下數四角中10個小方格的細胞數，記為N。有核細胞總數=（N/4）*10*20*106/L，計算肺泡灌洗液中白細胞總數。將離心后的細胞沉淀用生理鹽水重懸，沉淀混勻后，吸取10 μL細胞懸液涂片，待涂片風干后，至無水乙醇中固定10 min晾干，進行瑞氏-吉姆薩染色，于顯微鏡（油鏡）下計數100個細胞，計算中性粒細胞所占百分比，再乘以白細胞總數計算肺泡灌洗液中性粒細胞量。③炎性因子檢測：采用MSD技術（電化學發光技術）分別檢測肺組織、血清及肺泡灌洗液中的IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、KC/GRO。
1.3統計學處理
應用SPSS 20.0統計軟件對實驗數據進行獨立樣本T檢驗（T-檢驗），以P< 0.05 為差異有統計學意義。
2結果
2.1霧化LPS濃度及粒徑測定結果
檢測結果霧化LPS氣溶膠平均濃度為4.08g/m3，結果見圖1。粒徑測定結果顯示LPS霧化氣溶膠粒經：Dv(10)=0.6974(μm)，Dv(50)=3.387(μm)、Dv(90)= 8.836(μm)，Span=2.402，結果見圖2。霧化LPS氣溶膠粒徑持續監測圖見圖3。
2.2肺組織病理結果比較
光鏡病理觀察：鏡下顯示空白組各結構正常，連續、清晰，支氣管上皮完整，粘膜光滑，各層結構清晰，偶見散在炎性細胞，無滲出。模型組肺臟可見局灶或彌漫性肺泡上皮變性壞死伴脫落，炎細胞浸潤（中性粒細胞和單核細胞為主）等改變。其中，11#和13#動物肺泡上皮彌漫性脫落，重度，僅個別動物（12#、20#等）可見輕度的局灶性化膿性壞死，病變較輕，整體上呈現出的肺臟明顯的損傷。
肺組織病理半定量評分比較：上皮損傷。模型組、陽性對照組上皮細胞壞
死脫落發生率分別為：8/10、0/10。從損傷程度來看，模型組2只動物為重度肺泡上皮壞死脫落，陽性對照組未見肺泡上皮壞死脫落及炎性細胞浸潤。模型組、陽性對照組中性粒細胞浸潤在全部動物肺臟出現，但從程度上來看，模型組中性粒細胞浸潤發生率為10/10，均為中度以上，陽性對照組主要為輕度以下，中度中性粒細胞浸潤發生率為8/10?？梢姡栃詫φ战M可不同程度減輕炎性細胞浸潤的程度，其中，陽性對照組炎性細胞浸潤為輕度改變，多數動物肺泡上皮壞死脫落輕度以下，治療保護較好，局灶性化膿性炎。模型組局灶性化膿性壞死發生率為2/10，陽性藥組未見局灶性化膿性壞死。結果見表1，圖4。
表1 主要病變統計
注：根據病變的分布、嚴重程度和形態學特點使用合適的診斷術語并將病變分為4個等級：輕微、輕度、中度、重度，分別用+、++、+++、++++表示
圖4 病理圖片
注：A-1、A-2 空白對照組（分別為10×、40×）；B-1、B-2 模型組（分別為10×、40×）；C-1、C-2陽性對照組（分別為10×、40×）。
3.3肺泡灌洗液中性粒細胞數
與空白對照組比較，模型組中性粒細胞顯著升高（P< 0.01）。結果見圖5。
3.4炎性因子
肺組織中炎性因子的變化：與空白對照組比較，模型組的IL-1β、IL-6、KC/GRO含量顯著性升高（P<0.01，P<0.05，P<0.01）。
表3 肺組織炎性因子統計結果
肺泡灌洗液中炎性因子的變化：與空白對照組比較，模型組的IL-1β含量顯著升高（P<0.05），IL-6、TNF-α含量也明顯升高（P<0.001、P<0.001）。注：與空白組相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
表4 肺泡灌洗液炎性因子統計結果
血清中炎性因子的變化：與空白對照組比較，模型組的IL-10含量具有顯著性降低（P<0.05），IL-5含量明顯升高（P<0.05），KC/GRO含量明顯降低（P<0.01），TNF-α含量明顯降低（P<0.05），結合具體數據分析認為上述數值變化較小，數值的改變僅僅有統計學意義，無生物學意義。
表5 血清炎性因子統計結果
4 討論
使用LPS建立肺炎模型的方法主要有全身給藥法、氣管內給藥法、吸入法及霧化法。相對于其他給藥途徑的造模方式，霧化吸入給藥具有全身作用小、炎癥反應均勻、模型重復性好等優勢。在進行造模時LPS霧化粒徑的大小是模型成功和可重復的關鍵。當吸入氣溶膠粒徑在1-4 μm時，肺部的藥物沉積量相對穩定；當粒徑大于4 μm時，肺部的藥物沉積量會減少。本研究中，有50%的LPS霧化氣溶膠粒徑< 3.387 μm，提示LPS霧化顆粒主要沉積于肺泡。造模成功與否還與吸入的濃度相關，本研究中，用分光光度儀測定霧化的LPS氣溶膠濃度平均值為4.08g/m3左右。
病理結果顯示，模型組大鼠出現了較嚴重的上皮細胞脫落壞死以及肺臟中性粒細胞浸潤，偶見局灶性化膿性壞死。同時，肺泡灌洗液中的中性粒細胞數量對肺炎的評價也非常重要。對肺泡灌洗液中炎性細胞進行統計，結果與空白對照組比較，模型組中性粒細胞總數顯著升高（P< 0.01）。上述結果提示模型成功。
霧化給藥為肺部靶向給藥，藥物作用于氣管和肺組織，同時肺部作為呼吸器官，其炎癥反應還會反應在全身，因此觀察比較肺泡灌洗液、肺組織和血清炎性因子的改變。已有研究表明脂多糖LPS進入生物體內后，可以激活相關炎癥信號通路，促進炎癥因子的釋放。LPS導致的內毒素模型肺損傷，是通過兩個作用形成的。一是可以直接作用于內皮細胞，LPS 通過上調細胞因子，粘附分子和組織因子，導致內皮細胞的損傷。而且，LPS 還可以導致內皮細胞凋亡。另一個是激活宿主獲得性防御反應，包括細胞因子和體液因子進而導致大范圍的炎癥介質的釋放。脂多糖和大腸桿菌造成的肺損傷模型，共同的通路就是大量PMN的浸潤，激活，產生大量炎癥因子，包括IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、Interferon-α、Interferon-γ等，所以本研究中選取了IFN-γ、IL-10、IL-13、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、KC/GRO、TNF-α炎癥因子進行檢測。
造模后病理結果顯示，模型動物出現了出現明顯的肺損傷，肺灌洗液中白細胞計數顯著升高結果提示模型成功。炎性因子檢測結果顯示，模型組血清所測九種炎性因子均沒有出現有明顯生物學意義的顯著變化，而在肺組織和肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、KC/GRO以及TNF-α均出現具有一定生物學意義的變化，兩者變化基本一致，而IFN-γ、IL-4、IL-13變化不明顯。LPS吸入誘導的肺炎為局部靶向模型，其病變部位主要是在肺部局部，全身的炎癥反應并不明顯。產生變化的炎性因子主要是IL-1β、IL-6、KC/GRO以及TNF-α，推測主要是Th1細胞因子占主導作用，Th2細胞因子分泌相對較少，導致機體朝著炎癥方向發展。同時從實驗結果能夠看到，盡管肺組織和肺灌洗液中炎性因子均出現了顯著性變化，但是肺灌洗液中模型組相對空白組變化更顯著，標準差小，變化更為敏感。
制備方法
1材料與方法
1.1材料
1.1.1藥品及試劑
脂多糖(LPS)：sigma公司生產，批號：127M4030V。地塞米松磷酸鈉注射液：貴州天地藥業有限責任公司生產，批號：19110802A。三氯乙醛水合物：上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10636049。甲醛：福晨（天津）化學試劑有限公司生產，批號：20190920。生理鹽水：石家莊四藥有限公司生產，批號：2006192110。
1.1.2儀器
口鼻暴露吸入塔：Melton Inhalogic NIES 口鼻式吸入暴露系統，eppendorf離心機，型號centrifuge 5810R；電子天平：德國Sartorius公司生產，型號；BSA3202S-CW型；顯微鏡及圖像分析系統：日本olympus公司生產，型號；BX51；霧化器：PARI Turbo BOY N霧化器；CEL-712 Microdust Pro監測儀；Spraytec實時噴霧粒度分析儀，英國馬爾文公司。
1.2方法
將CEL-712 Microdust Pro監測儀插入到Melton Inhalogic NIES口鼻式吸入暴露系統的暴露孔，對霧化氣溶膠進行濃度進行監測。Wistar大鼠，170 ~190g，雄性，適應性喂養5天，開始試驗。在霧化器中裝入4 mg/mL的LPS溶液，口鼻暴露系統與霧化裝置連接，霧化吸入給與大鼠LPS溶液(LPS霧化中位粒徑3um左右)15 min進行造模，每次霧化藥液體積約為5mL，連續三天，第四天早上即第三次造模后16 h各組進行取材。
樣本采集：造模后16 h用10%的水合氯醛麻醉（0.35 mL/100g），腹主動脈采血，暴露胸腔，右葉結扎，用生理鹽水灌洗左肺，緩緩打入，靜止平衡30 s，緩緩抽出，1 mL/次，灌洗2次，灌洗速度2 mL/min（30 s/次），合并灌洗液（回收率＞60%）。Wright-Giemsa染色法觀察肺泡灌洗液中炎癥細胞（巨噬細胞、中性粒細胞）含量。右肺用4%甲醛固定，室溫保存，待進一步病理檢測，制備石蠟切片供組織學檢查。
觀察指標：①肺組織病理形態學檢查：將肺組織進行包埋、切片以及HE染色制備成肺組織病理切片，在光學顯微鏡下進行觀察，進行肺組織病理損傷評分。②肺泡灌洗液中性粒細胞計數：肺泡灌洗液離心，將重懸后的肺泡灌洗液稀釋，制成均勻的細胞懸液，取10 μL加至細胞計數板上，靜止3 min，待細胞完全沉淀后，在低倍鏡下數四角中10個小方格的細胞數，記為N。有核細胞總數=（N/4）*10*20*106/L，計算肺泡灌洗液中白細胞總數。將離心后的細胞沉淀用生理鹽水重懸，沉淀混勻后，吸取10 μL細胞懸液涂片，待涂片風干后，至無水乙醇中固定10 min晾干，進行瑞氏-吉姆薩染色，于顯微鏡（油鏡）下計數100個細胞，計算中性粒細胞所占百分比，再乘以白細胞總數計算肺泡灌洗液中性粒細胞量。③炎性因子檢測：監測肺組織中的IL-1β、IL-6以及TNF-α含量。
研究背景
1.目的
采用霧化吸入脂多糖（LPS）以肺灌洗液白細胞計數、肺組織炎性因子以及肺組織的病理學改變為模型評價指標優化LPS誘導的大鼠急性肺炎模型。
2. 意義
脂多糖（LPS）常作為急性肺損傷的誘導劑，也是目前公認的誘導動物急性肺炎模型的藥物。研究采用霧化吸入的方法成功建立急性肺炎模型，相對于目前常用的腹腔注射、尾靜脈注射、氣管注射和氣管滴注等方法該建模方法具有全身副作用輕，成模率高，肺部病變均勻，重復性好的作用特點，為肺炎發病機制研究以及發病早期診斷等提供一定的實驗依據。
3.國內外研究進展
脂多糖（LPS）是革蘭陰性細菌細胞壁的組成部分，可誘使炎癥因子的釋放[1][2]，常作為急性肺損傷的誘導劑，也是目前公認的誘導動物急性肺炎模型的藥物[3][4]。已有研究表明脂多糖LPS進入機體后，可以激活相關炎癥信號通路[5]，導致炎癥聯級反應[6]，從而促進炎癥因子的釋放，如TNF-α、IL-1β、IL-6等均在ALI/ARDS病程進展中有非常重要的作用[7]。目前動物主要選擇嚙齒類動物：大小鼠。而構建模型中LPS誘導劑的給藥途徑和劑量差異較大。造模方法包括腹腔注射給藥、尾靜脈全身給藥法[8-10]和氣管滴注、氣管注射[11、12]以及氣管吸入[13、14]、滴鼻法[15-17]等氣管局部給藥法。不同給藥方式有不同的優缺點。全身給藥操作方法較為簡單，但往往會引起全身炎癥，且血中炎癥細胞及炎癥因子不能很好地反映肺部受損的嚴重程度[8、10]；氣管內注射法可準確的控制給藥劑量，但其切口可能會被微生物感染而出現炎癥，影響實驗結果；經口氣管內給藥法無傷口，但對操作要求較高，需準確找到聲門，同時可能藥物會僅作用在某一葉肺葉，不能造成全肺感染［18］；口咽吸入法和滴鼻法操作較簡單，但進入下呼吸道的LPS 溶液量不可控，可能使實驗結果產生較大變異［19］，霧化吸入法是通過自主呼吸給藥，操作簡單，成模率高，有很好的重復性，最接近肺炎發病的過程，在造模中具有一定的優勢[20]。
參考文獻：
[1]Kapoork, SinglaE, SahuB, et al. PARP inhibitor,Olaparib ameliorates acute lung and kidney injury upon intratratracheal administration of LPS in mice[J]. Mol Cell Biochem, 2015, 400(1-2): 153-162.
[2]XuXP, HuangLL, HuSL, et al. Genetic modification of mesenchymal stem cells over expressing angiotensin Ⅱtype 2 receptor increases cell migration to injured lung in LPS-induced acute lung injury mice[J]. Stem Cells Transl Med, 2018,7(10):721-730.
[3]Kong G, Huang X, Wang L, et al. Astilbin alleviates LPS induced ARDS by suppressing MAPK signaling pathway and protecting pulmonary endothelial glycocalyx[J]. Int Immunopharmacol, 2016, 36: 51-58．
[4]Lv H, Liu Q, Wen Z, et al. Xanthohumol ameliorates lipopolysaccharide ( LPS ) -induced acute lung injury via induction of AMPK/GSK3β-Nrf2 signal axis ［J］. Redox Biol, 2017, 12: 311-324．
[5]Zhang Y，Xu T，Pan Z，et al. Shikonin inhibits myeloid differentiation protein 2 to prevent LPS-induced acute lung injury[J]. Br J Pharmacol, 2018, 175（5）：840-854.
[6]Lu YC，Yeh WC，Ohashi PS.LPS/TLR4 signal transduction pathway[J]. Cytokine, 2008, 42（2）: 145-151.
[7]Chen X, Tang J, Shuai W, et al. Macrophage polarization and its role in the pathogenesis of acute lung injury/acute respiratory distress syndrome[J], 2020 Jul 10. Inflamm Res, 2020：1-13.
[8]袁偉鋒，李理，徐虹，等．氣管內滴入與腹膜腔注射脂多糖致肺組織炎癥損傷的動態變化比較［J］,中國呼吸與危重監護雜志，2017，16(3): 274－279．
[9]Wu DQ，Wu HB，Zhang M，et al． Effects of zinc finger proteinA20 on lipopolysaccharide ( LPS )-induced pulmonaryinflammation/anti-inflammatory mediators in an acute lunginjury/acute respiratory distress syndrome rat model［J］．Med SciMonit，2017，23: 3536－3545．
[10]李洪霞，張進川，劉巖．氣管滴入及腹腔注入內毒素致大鼠急性肺損傷機制的研究［J］． 軍醫進修學院學報，2003，24(1): 4－6．
[11]Brown EJ，Johansen M，Looney MR，et al． CD47 deficiency protects mice from lipopolysaccharide-induced acute lung injury and Escherichia coli pneumonia［J］． J Immunol，2008，180(10): 6947－6953．
[12]Conti G，Tambalo S，Villetti G，et al． Evaluation of lungin flammation induced by intratracheal administration of LPS in mice: comparison between MRI and histology［J］． MAGMA，2010，23(2): 93－101．
[13]．金婉冰． 白藜蘆醇對脂多糖誘導的小鼠重癥肺炎的保護作用［J］,中國臨床藥理學與治療學，2011，16(12): 1352－1356．
[14]楊東，仇瑋祎，張暢，等． 地塞米松治療 LPS 誘導急性肺炎模型小鼠病理學評價方法的建立［J］． 實驗動物科學，2013，30(4): 9－12，65．
[15]Ni YL，Shen HT，Su CH，et al． Nerolidol suppresses the inflammatory response during lipopolysaccharide-induced acute lung injury via the modulation of antioxidant enzymes and the AMPK/Nrf－ 2/HO － 1 pathway［J］,Oxid Med Cell Longev，2019，2019: 9605980．
[16]Lee JW，Ryu HW，Lee SU，et al． Pistacia weinmannifolia ameliorates cigarette smoke and lipopolysaccharide-induced pulmonary inflammation by inhibiting interleukin-8 production and NF-κB activation［J］,Int J Mol Med，2019，44(3): 949－959．
[17]D'Almeida APL，Pacheco de OMT，de Souza T，et al．α-bisabolol-loaded lipid-core nanocapsules reduce lipopolysaccharide-induced pulmonary inflammation in mice［J］,Int J Nanomedicine，2017，12: 4479－4491．
[18]Hraiech S，Papazian L，Rolain JM，et al． Animal models of polymicrobial pneumonia［J］，Drug Des Devel Ther，2015，9:3279－3292．
[19]Su X，Looney M，Robriquet L，et al． Direct visual instillation as a method for efficient delivery of fluid into the distal airspaces of anesthetized mice［J］，Exp Lung Res，2004，30(6): 479－493．
[20]張亞平，張廣平，蘇萍，等．不同途徑吸入脂多糖致大鼠急性肺炎模型的優選［J］，中國實驗方劑學雜志，2018，24(7): 82－88．
模型信息
中文名稱:霧化吸入LPS致肺炎大鼠模型
英文名稱:Pneumonia rat model induced by aerosol inhalation of LPS
類型:肺炎動物模型
分級:C級
用途:為肺炎發病機制研究以及發病早期診斷等提供一定的實驗依據。
研制單位:中國中醫科學院中藥研究所
保存單位:中國中醫科學院中藥研究所
