固定抗血清–稀釋病毒法
實(shí)驗(yàn)材料：已知標(biāo)準(zhǔn)的抗病毒血清 (20抗體單位 0. 1 ml)
試劑、試劑盒：已知陰性血清 (56℃ 30 min 滅活） 宿主：敏感細(xì)胞、敏感動(dòng)物、雞胚
儀器、耗材：細(xì)胞培養(yǎng)板、水浴鍋、細(xì)胞培養(yǎng)箱
實(shí)驗(yàn)步驟：
①用細(xì)胞維持液連續(xù) 10倍稀釋病毒分離物10-1~10-8);
②取 0. 6ml不同濃度的病毒稀釋液與 0. 6 ml 標(biāo)準(zhǔn)的抗病毒血清混合；
③再取 0.6ml 不同濃度的病毒稀釋液與 0. 6 ml 已知的陰性血清混合；
④將混合液置 37℃ 水浴1h, 然后取 0. 2 ml 混合液分別接種于細(xì)胞已長(zhǎng)成單層的 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種 5孔，設(shè) 5 孔正常細(xì)胞對(duì)照；
⑤將細(xì)胞培養(yǎng)板置 37℃ 、 5% CO2 溫箱中孵育，每日觀察細(xì)胞病變效應(yīng) (CPE) 。
⑥中和試驗(yàn)的病毒 CCID50 的計(jì)算：細(xì)胞培養(yǎng)中，通常是以病毒的組織半數(shù)感染量 (CCID50/單位體積）作為中和反應(yīng)的終點(diǎn)。而動(dòng)物試驗(yàn)中，用動(dòng)物半數(shù)致死量 (LD50/單位體積）作為中和反應(yīng)的終點(diǎn)。中和試驗(yàn)中，抗血清組的 CCID50 與陰性血清組的 CCID50 之差的對(duì)數(shù)等于或大于2, 才能說明中和試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。
注意事項(xiàng)：
用中和試驗(yàn)方法鑒定病毒時(shí)，將不同稀釋倍數(shù)的病毒與標(biāo)準(zhǔn)的抗血清 (20個(gè)抗體單位/單位體積）混合、孵育，使二者充分反應(yīng)，然后將混合液接種到敏感宿主體內(nèi)，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

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固定病毒–稀釋抗血清法
該病毒中和試驗(yàn)方法主要用于血清抗體滴度的測(cè)量。將 100 CCID50/單位體積的病毒分別與連續(xù)倍比稀釋的病人急性期或恢復(fù)期血清混合孵育 1 h 后，把混合液接種于敏感宿主，然后觀察不同稀釋度的血清保護(hù)宿主感染病毒的情況。
實(shí)驗(yàn)材料：
具有感染力的病毒（已滴定的標(biāo)準(zhǔn)病毒 100 TCID50 0. 1 ml 或 100 LD50 0. 1 ml）
試劑、試劑盒：
病毒抗體陽(yáng)性的血清和病毒抗體陰性的血清：急性期或恢復(fù)期血清（通常 56℃ 30 min 滅活） 敏感宿主體系：敏感細(xì)胞、敏感動(dòng)物、雞胚
儀器、耗材：
96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板
實(shí)驗(yàn)步驟：以細(xì)胞培養(yǎng)為例
①用細(xì)胞維持液連續(xù)倍比稀釋急性期和恢復(fù)期血清；
②取1. 0 ml 不同濃度的稀釋血清分別與 1. 0 ml 標(biāo)準(zhǔn)病毒 (100 CCID50/0. 1 m) 混合，置 37℃水浴作用1 h;
③取混合液 0. 2 ml 分別加到細(xì)胞已長(zhǎng)成單層的 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種 4孔細(xì)胞。同時(shí)設(shè) 4孔正常細(xì)胞對(duì)照和設(shè) 4 孔 100 CCID50/0. 2 ml 作病毒對(duì)照；
④設(shè)病毒滴度對(duì)照。將病毒液連續(xù) 10倍稀釋后，加到細(xì)胞已長(zhǎng)成單層的 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度接種 4孔細(xì)胞，每孔加 0. 1 ml。必要時(shí)還要設(shè)抗體陽(yáng)性血清對(duì)照和抗體陰性血清對(duì)照。
⑤將 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板置 37℃、 5% CO2 溫箱中孵育，每日觀察細(xì)胞病變效應(yīng) (CPE) 。
⑥50% 血清中和終點(diǎn)的計(jì)算： 50% 細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞病變 (CPE) 的血清稀釋度。根據(jù)細(xì)胞病變程度，用 Reed-Muench 法計(jì)算 50%血清中和終點(diǎn)。
注意事項(xiàng)：
1. 病毒懸液病毒應(yīng)低溫保存，融化后只可使用一次，避免反復(fù)凍融，這樣會(huì)降低病毒的毒力。多次進(jìn)行同一試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)使用同一批凍存的病毒，以減小誤差。
2. 抗血清人和動(dòng)物血清中含有一些非特異性的物質(zhì)，這些物質(zhì)可增強(qiáng)抗病毒抗體的中和作用，也可以滅活病毒，通常采用加熱的方法破壞這些物質(zhì)。不同來源的血清滅活溫度不盡相同，人、豚鼠血清為 56℃, 兔為 65℃, 時(shí)間為 20~30 min。在細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行中和試驗(yàn)時(shí)，要注意避免使用相同的細(xì)胞。
3. 孵育的溫度和時(shí)間 病毒與抗血清在 0℃時(shí)不發(fā)生反應(yīng)， 5℃以上才發(fā)生中和反應(yīng)。通常采用 37℃ 孵育1 h, 一般的病毒即可和抗血清充分反應(yīng)。但是，一些特殊的病毒在此反應(yīng)條件下不能充分反應(yīng)，試驗(yàn)時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的病毒改變孵育的時(shí)間和溫度。

病毒中和試驗(yàn)主要有兩種實(shí)驗(yàn)方法：固定病毒–稀釋抗血清法和固定抗血清–稀釋病毒法。