束縛，是一種將動(dòng)物置于無法逃脫的應(yīng)激環(huán)境中，通過行為制動(dòng)的方式，模擬人類社會(huì)中無法避免的擁擠、壓力性空間等應(yīng)激因素。由于其對動(dòng)物沒有電擊等物理性刺激，減少了動(dòng)物的軀體應(yīng)激反應(yīng)，與獲得性無助、不可預(yù)測性應(yīng)激等慢性心理應(yīng)激模型相比，是建立單純心理應(yīng)激所致學(xué)習(xí)記憶障礙更適宜的造模方法。慢性束縛，是持續(xù)時(shí)間較長的一種造模方式，一般造模時(shí)間大于1 d。更好的模擬了現(xiàn)代社會(huì)中，人們面臨的壓力持續(xù)時(shí)間增加的情況。本研究通過兩種不同的認(rèn)知行為學(xué)評價(jià)方法考察束縛應(yīng)激對SD和Wistar大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)是考察動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的一種常用方法。結(jié)果表明慢性束縛應(yīng)激(10 h，28 d)對SD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的損傷更明顯。新物體識別實(shí)驗(yàn)是評價(jià)動(dòng)物識別記憶的簡單、靈敏的方法。結(jié)果表明SD和Wistar模型大鼠在熟悉期表現(xiàn)出與各自對照組相同的探索能力，但是檢測期的辨別指數(shù)與對照組比出現(xiàn)差異。這排除了探索行為的改變對認(rèn)知檢測結(jié)果的干擾，同時(shí)表明束縛應(yīng)激對大鼠的識別記憶能力產(chǎn)生損傷，且對SD大鼠的損傷更明顯。水迷宮工作記憶實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明慢性束縛應(yīng)激對SD大鼠的非空間學(xué)習(xí)記憶能力的損傷較Wistar大鼠更明顯。兩種檢測方法中，水迷宮對動(dòng)物的體力要求較高，其具體體現(xiàn)在游泳速度上。束縛應(yīng)激在對速度的影響不顯著的情況下，可引起空間學(xué)習(xí)能力、工作記憶的損傷。進(jìn)而表明體重下降只是應(yīng)激引起的外周作用的一種表現(xiàn)，與學(xué)習(xí)記憶能力并沒有一定的相關(guān)性。

獎(jiǎng)勵(lì)性操作條件反射是一種復(fù)雜的條件反射，它涉及到對反應(yīng)與獎(jiǎng)勵(lì)之間的操作行為后果因果聯(lián)系的認(rèn)知。評價(jià)指標(biāo)包括動(dòng)物的踏板次數(shù)、鼻觸次數(shù)及完成任務(wù)所需要的時(shí)間。適應(yīng)訓(xùn)練過程沒有條件性刺激和踏板伸出，動(dòng)物自由的探索測試箱。獎(jiǎng)賞適應(yīng)階段的鼻觸次數(shù)能夠反映出動(dòng)物對獎(jiǎng)勵(lì)物質(zhì)的興趣程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應(yīng)激大鼠（6h和10h，28天）在適應(yīng)訓(xùn)練中的鼻觸次數(shù)、運(yùn)動(dòng)路程、平均速度和糖水消耗量與對照組比較均沒有顯著性差異，表明慢性束縛應(yīng)激并不會(huì)損害動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力和對獎(jiǎng)賞的興趣。

獎(jiǎng)勵(lì)性條件反射訓(xùn)練中，條件性刺激與獎(jiǎng)賞（20%蔗糖水）反應(yīng)配對出現(xiàn)，動(dòng)物需要記住只有當(dāng)藍(lán)色信號燈亮?xí)r才能夠獲得獎(jiǎng)勵(lì)。慢性束縛應(yīng)激（6h和10h，28天）嚴(yán)重的損傷了激勵(lì)性條件反射的習(xí)得，主要表現(xiàn)在慢性應(yīng)激組動(dòng)物的NPs 顯著性的低于對照組，說明了慢性束縛應(yīng)激能夠損害動(dòng)物的獎(jiǎng)勵(lì)性條件反射的獲得。同樣應(yīng)激組的NPs并沒有像對照組一樣表現(xiàn)出上升的趨勢， 其可能的原因是，由于慢性應(yīng)激導(dǎo)致動(dòng)物獲得獎(jiǎng)勵(lì)的次數(shù)降低，進(jìn)而降低了獎(jiǎng)勵(lì)物質(zhì)的內(nèi)在價(jià)值，動(dòng)物逐漸失去探索獎(jiǎng)勵(lì)的動(dòng)機(jī)，逐漸停止探索行為。

在獎(jiǎng)勵(lì)性操作條件反射學(xué)習(xí)過程中：慢性束縛應(yīng)激（6h和10h，28天）后，動(dòng)物的LPs、NPs 和LP/NP 顯著性的降低。同樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激組大鼠表現(xiàn)出訓(xùn)練 day1-4 NPs顯著性減少，day5-day10恢復(fù)正常，表明了訓(xùn)練前給予慢性束縛應(yīng)激嚴(yán)重?fù)p害了操作件反射的獲得。但是，通過增加訓(xùn)練次數(shù)可能彌補(bǔ)這些損害作用。

動(dòng)物是在形成操作式條件反射后接受慢性束縛應(yīng)激，然后將動(dòng)物按照起初的訓(xùn)練環(huán)境引起記憶回放。慢性應(yīng)激組LP/NP和完成任務(wù)需要的時(shí)間顯著性的低于對照組，說明了應(yīng)激動(dòng)物的記憶檢索能力受到一定程度的損害，這也說明了慢性束縛應(yīng)激削弱了準(zhǔn)確的回憶操作-后果關(guān)聯(lián)的能力。當(dāng)獲取獎(jiǎng)勵(lì)的規(guī)則改變時(shí)，動(dòng)物需要重新付出努力再次學(xué)習(xí)新的踏板操作-后果之間的關(guān)聯(lián)反應(yīng)。因此，我們利用高比率操作反應(yīng)來評價(jià)這種行為靈活性。通過我們設(shè)定的獎(jiǎng)勵(lì)獲取規(guī)則，動(dòng)物僅在2（或 3 s）內(nèi)連續(xù)踏板2次（或4次）才能獲取獎(jiǎng)勵(lì)。慢性應(yīng)激大鼠在訓(xùn)練起初表現(xiàn)出踏板操作的盲目性和連續(xù)性，慢性應(yīng)激大鼠獲得的獎(jiǎng)勵(lì)和LP/NP 顯著性低于對照組，以及動(dòng)物不能有效的將獎(jiǎng)賞和一系列的踏板操作聯(lián)系起來，表現(xiàn)出持續(xù)性的效率低下。

此外，本實(shí)驗(yàn)室和文獻(xiàn)均對不同時(shí)間慢性束縛應(yīng)激引起的學(xué)習(xí)記憶障礙有所研究，即除上述實(shí)驗(yàn)外，本課題組還探究了Wistar雌雄大鼠每天束縛6h，連續(xù)7天、14天、21天、28天和35天，利用水迷宮實(shí)驗(yàn)和穿梭實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對學(xué)習(xí)記憶能力的評價(jià)。結(jié)果顯示以上各組別的模型大鼠和對照組相比各指標(biāo)都無差異，且模型組大鼠在某些時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出相對對照組學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)的現(xiàn)象。雌性大鼠每天束縛10h，在第28天時(shí)，自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)第二天出現(xiàn)總總游程和總時(shí)間的延長，但第三天差異消失，這可以一定程度上反映大鼠每天束縛10h、連續(xù)28天可能會(huì)造成大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，但模型表現(xiàn)不穩(wěn)定，需要加長每天束縛時(shí)間確保模型的可重復(fù)性。因此，將每天束縛時(shí)間延長至14h，利用水迷宮實(shí)驗(yàn)、穿梭實(shí)驗(yàn)、新奇事物實(shí)驗(yàn)來評價(jià)模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。連續(xù)束縛28天后模型組雌雄大鼠在新奇事物實(shí)驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出與對照組明顯差異，故認(rèn)為雌雄大鼠在每天束縛14h連續(xù)28天后導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。且本次研究中慢性束縛應(yīng)激（10 h/28 d），在新物體識別實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)中SD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損傷較Wistar大鼠明顯。另外，慢性束縛應(yīng)激（6h和10h，28天）能降低Wistar大鼠在獎(jiǎng)勵(lì)性操作條件行為學(xué)檢測中不同階段對記憶的主動(dòng)操作能力、學(xué)習(xí)記憶獲得、維持、再學(xué)習(xí)能力。此外，課題組還報(bào)道了ICR小鼠經(jīng)慢性束縛應(yīng)激10h，28天損傷了動(dòng)物在新物體、物體位置識別實(shí)驗(yàn)和水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中的學(xué)習(xí)記憶能力，與對照組相比具有顯著性差異。故我們推薦慢性束縛應(yīng)激10h和14h，28天致使SD和Wistar大鼠新奇事物實(shí)驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)中的學(xué)習(xí)記憶損傷，且14h，28天造模時(shí)間更穩(wěn)定。慢性束縛應(yīng)激（6h和10h，28天）均能降低Wistar大鼠在獎(jiǎng)勵(lì)性操作條件行為學(xué)檢測中不同階段對記憶的主動(dòng)操作能力、學(xué)習(xí)記憶獲得、維持、再學(xué)習(xí)能力。慢性束縛應(yīng)激10h，28天致使ICR小鼠在物體識別實(shí)驗(yàn)（新物體和物體位置）和水迷宮實(shí)驗(yàn)中的學(xué)習(xí)記憶損傷。

分子機(jī)制結(jié)果表明長期束縛應(yīng)激（6h和10 h/day，28 days）均可引起大鼠BDNF表達(dá)減少，繼而引起GR介導(dǎo)的BDNF 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻。此外Egr-1和Synapsin-1等蛋白表達(dá)均明顯的降低。神經(jīng)遞質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)應(yīng)激組大鼠前額皮層Ach，E和NE無變化，Glu 顯著性升高，5-HT的含量降低。氧化應(yīng)激檢測發(fā)現(xiàn)慢性束縛應(yīng)激10h，28天可引起ICR小鼠血清中丙二醛含量的升高以及降低總抗氧化能力。

模型技術(shù)難點(diǎn)在于由于束縛器是樹脂材料的圓柱形，頂端有數(shù)個(gè)通氣的小孔，各組動(dòng)物體重的控制應(yīng)在適宜范圍之內(nèi)，滿足其在束縛器中身體不能翻轉(zhuǎn)，只能保持頭部活動(dòng)保持正常呼吸。另外，在束縛早期由于動(dòng)物掙扎劇烈，會(huì)出現(xiàn)動(dòng)物窒息的情況，所以一開始需要我們24 h觀察，及時(shí)排除動(dòng)物窒息死亡的情形。

與其他應(yīng)激模式不同：慢性束縛應(yīng)激是將動(dòng)物置于無法逃脫的應(yīng)激環(huán)境中，通過行為制動(dòng)的方式，較好的模擬了宇航員在太空中飛行和現(xiàn)代人類社會(huì)長期處于擁擠、狹小空間作業(yè)而引起的認(rèn)知損傷。

本實(shí)驗(yàn)采用健康成年SPF級大鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物用水均經(jīng)過除菌處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以完整的包裝直接進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，觀察適應(yīng)5天后無異常情況，方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）藥品與試劑：

BDNF，TrkB，Erk1/2，Egr-1，GR和Synapsin-1 rabbit mAb（Cell Signaling）

（2）儀器：

① 行為學(xué)檢測：大鼠水迷宮計(jì)算機(jī)監(jiān)測分析系統(tǒng)、物體識別檢測箱、獎(jiǎng)勵(lì)性操作條件反射測試箱

② 蛋白含量檢測：制冰機(jī)（意大利Icematic公司）、電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）、超聲細(xì)胞破碎儀（美國Sonics公司）、TS-1脫色搖床（江蘇海門其林貝樂公司）、雙垂直板電泳槽（美國Bio-Rad公司）、Gel Doc XR凝膠成像（美國Bio-Rad公司）、移液槍（德國Eppendorf公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。

2 評價(jià)方法

（1）行為學(xué)評價(jià):

① 水迷宮空間記憶實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)中，圓形迷宮直徑為 159 cm、高 50 cm， 池中水深25. 5 cm 左右，內(nèi)置平臺直徑 9 cm、高 24 cm，水溫維持在( 24 ± 1) ℃。將迷宮置于空間信息相對豐富的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，作為動(dòng)物學(xué)習(xí)過程中的空間參照物，整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)保持環(huán)境信息固定不變。將迷宮均分為4個(gè)象限，將平臺置于其中一個(gè)象限中央，作為實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物逃離水環(huán)境的唯一途徑，空間記憶階段保持平臺位置固定不變。選擇其余3個(gè)象限作為動(dòng)物的入水點(diǎn)將動(dòng)物面向池壁放入水中，每天訓(xùn)練 3次，每次變換入水點(diǎn)位置(使動(dòng)物可分別從3個(gè)象限入水) ，且每天所有動(dòng)物入水點(diǎn)的順序保持一致。每次訓(xùn)練前適應(yīng) 10 s，使動(dòng)物獲取并學(xué)習(xí)空間環(huán)境信息。設(shè)置檢測時(shí)間為60s后，將動(dòng)物放入水中，若動(dòng)物在60 s內(nèi)找到平臺，算作尋臺成功并記錄其潛伏期，并使其在平臺上停留休息10 s。若動(dòng)物在 60 s內(nèi)未找到平臺，結(jié)束此次訓(xùn)練并記錄潛伏期為60 s，并引導(dǎo)動(dòng)物靠近平臺使其在平臺上停留 10 s。每只動(dòng)物訓(xùn)練的時(shí)間間隔為40 min。每天每只動(dòng)物3次訓(xùn)練學(xué)習(xí)的潛伏期平均值，作為評價(jià)動(dòng)物這一天學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。經(jīng)過5d的訓(xùn)練學(xué)習(xí)后，第6天撤去平臺，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。將動(dòng)物從原平臺象限的對角象限面向池壁放入水中， 檢測其在60s內(nèi)在原平臺象限的游程比、時(shí)間比，以及穿過原平臺所在位置的次數(shù)，作為評價(jià)空間記憶能力的指標(biāo)。

② 水迷宮工作記憶實(shí)驗(yàn)

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日，開始工作記憶實(shí)驗(yàn)。工作記憶歷時(shí)3d，分別將平臺置于其余 3 個(gè)不同象限中，每天變換平臺位置，同一天內(nèi)平臺位置保持不變。每天訓(xùn)練3次，依次從其余3個(gè)非平臺象限將動(dòng)物面朝池壁放入水中。訓(xùn)練前不予適應(yīng)，其余同空間訓(xùn)練階段一致。計(jì)算3天中，第2次訓(xùn)練潛伏期的平均值，作為評價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。

③ 新物體識別實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)箱為黑色聚酯塑料材質(zhì)構(gòu)成的封閉箱，體積為60 cm × 40 cm × 80 cm， 箱體左右兩側(cè)各有兩排LED燈條照明， 既避免了強(qiáng)光直射對動(dòng)物行為的干擾，又可以作為計(jì)算機(jī)對動(dòng)物行為識別的背景光。頂部采用攝像頭觀察動(dòng)物的活動(dòng)情況及探索過程。實(shí)驗(yàn)過程分為3個(gè)階段: 適應(yīng)期、熟悉期、測試期。適應(yīng)期為 3d， 每天將動(dòng)物依次放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，熟悉環(huán)境10 min。適應(yīng)期結(jié)束后，次日進(jìn)行熟悉和測試。熟悉期時(shí)，將兩個(gè)完全相同的物體放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)對稱的位置處，此兩物體距離側(cè)箱壁、箱后壁的距離均為10 cm。記錄大鼠5 min 內(nèi)對兩物體的探索總時(shí)間。間隔30 min后，進(jìn)入測試期。測試期內(nèi)，將其中一個(gè)熟悉物體換為另一個(gè)大小相近但形狀和顏色不同的新穎物體， 記錄大鼠對新穎物體和

熟悉物體的探索時(shí)間，用辨別指數(shù) (discriminationindex，DI) 來評價(jià)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。辨別指數(shù)計(jì)算公式為 DI = ( N-F) /( N + F) × 100%，其中N( new) 為新穎物體探索時(shí)間，F(xiàn)( familiar) 為熟悉體探索時(shí)間。

此外基于該模型行為學(xué)評評價(jià)方法包括獎(jiǎng)勵(lì)性操作條件反射實(shí)驗(yàn)步驟如下：

① 適應(yīng)模式：

束縛 28 d 后將動(dòng)物放進(jìn)測試箱內(nèi)進(jìn)行適應(yīng)訓(xùn)練， 其方法為：束縛大鼠去除束縛器后，在動(dòng)物籠內(nèi)恢復(fù) 30 min，恢復(fù)期間將動(dòng)物搬進(jìn)測試箱房間內(nèi)，適應(yīng)測試間的環(huán)境 30 min。 30 min 后將大鼠按照順序放進(jìn)測試箱內(nèi)，打開操作系統(tǒng)，進(jìn)入自由適應(yīng)模式， 將亮燈時(shí)間調(diào)整為 0 s，即試驗(yàn)中沒有信號燈的指示。獎(jiǎng)賞物質(zhì)每 60 ±10 s 自動(dòng)給出，動(dòng)物在測試箱內(nèi)自由的探索，并做出鼻觸反應(yīng)獲取獎(jiǎng)勵(lì)。適應(yīng)期間記錄動(dòng)物鼻觸次數(shù)及運(yùn)動(dòng)路程、平均速度指標(biāo)。

② 獎(jiǎng)勵(lì)性條件反射實(shí)驗(yàn):

利用獎(jiǎng)勵(lì)性條件反射測試系統(tǒng)，對造模實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行檢測。應(yīng)用自由適應(yīng)模式，此模式為信號燈亮，獎(jiǎng)賞物質(zhì)給出。以動(dòng)物探頭次數(shù)（NP）為評價(jià)指標(biāo)。動(dòng)物探頭喝水反應(yīng)了動(dòng)物對飲水盒的位置記憶與探索興趣程度，此階段訓(xùn)練的目的使動(dòng)物得到獎(jiǎng)賞物質(zhì)可在飲水盒內(nèi)獲得的信息；使動(dòng)物將信號燈亮與獎(jiǎng)賞物質(zhì)之間形成經(jīng)典條件反射。

③ 獎(jiǎng)勵(lì)性操作條件反射

獎(jiǎng)勵(lì)性條件反射訓(xùn)練結(jié)束后，采用連續(xù)強(qiáng)化方式，即完成踏板操作1次即可獲得一次獎(jiǎng)勵(lì)，直到獲得50次獎(jiǎng)勵(lì)或者 30 min 試驗(yàn)時(shí)間結(jié)束。

④ 獎(jiǎng)勵(lì)性操作條件反射鞏固再現(xiàn)及復(fù)雜操作

當(dāng)動(dòng)物連續(xù)3 天在規(guī)定的 30 min 內(nèi)成功獲得 50 次獎(jiǎng)賞，此算做習(xí)得獎(jiǎng)勵(lì)性操作條件反射，然后可以終止實(shí)驗(yàn)進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)（FR=1）；連續(xù)多次踏板操作是指要求動(dòng)物連續(xù)踏板2 次或者 4 次才能獲得 1 次獎(jiǎng)賞，而連續(xù)踏板要求在2 s 或4 s內(nèi)完成。

（3）蛋白含量檢測

① 組織蛋白的提取

每組各3個(gè)海馬組織，稱重，每10mg組織加入100 μl預(yù)冷的裂解液；冰上超聲破碎，制成10%組織勻漿。再置冰上裂解30 min：將組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管，4℃離心（20min，12000 rpm/min）；取上清液，用BCA法測定蛋白濃度；加4x上樣緩沖液，沸水浴變性5min，快速冷卻，分裝，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

② SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

配制分離膠。將分離膠注入垂直放置的玻璃板縫隙中，頂層加入1cm高度的異丙醇覆蓋膠面。室溫靜置至凝膠與異丙醇之間有一水平的清晰界面，倒掉異丙醇，用濾紙凝膠頂部液體。配制濃縮膠。將配好的濃縮膠注入玻璃板問隙。立即插入齒梳，室溫靜置30 min左右。電泳。將凝膠插入垂直電泳槽中，小心拔出梳子，加滿電泳緩沖液，往梳孔中加入蛋白分子量marker（3μl/孔）和樣品（8μl/孔）；電壓80 V，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后,將電壓增至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)接近分離膠底部。關(guān)閉電源，取下凝膠，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

③ 轉(zhuǎn)膜

按照凝膠大小，剪PVDF膜和兩張Bio-RAD專用濾紙，將剪好的濾紙，海綿墊和夾子在電轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡20min。PVDF膜用甲醇浸泡5min：在轉(zhuǎn)膜夾中，從負(fù)極（黑色）到正極（白色）依次排放：海綿墊—濾紙—凝膠—PVDF膜—濾紙—海綿墊，蓋好正極板，插入電轉(zhuǎn)移槽，倒入電轉(zhuǎn)移液，蓋上蓋；冰浴電轉(zhuǎn)，350mA, 1h。

④ 封閉及抗原抗體反應(yīng)

電轉(zhuǎn)完畢后，將PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的TBST中，室溫輕搖1h。將PVDF膜封入自封袋中，加入一抗稀釋液，將膜完全覆蓋，趕出氣泡，4℃過夜。一抗雜交后用10%TBST洗10 min，每次溫振搖，共3次。洗滌后，將PVDF膜封入自封袋中，加入一抗稀釋液，將膜完全覆蓋，趕出氣泡，室溫孵育1h。二抗雜交后用10%TBST洗滌10 min，每次室溫振搖，共３次。將A液和B液按1：1比例混勻配制化學(xué)發(fā)光液，避光保存；將膜放于剪好的自封袋中，均勻滴加發(fā)光液，暗處放置3min；置于凝膠電泳顯色儀中照相。

(4) 神經(jīng)遞質(zhì)檢測

腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的檢測采用LC-MS/MS分析方法，可同時(shí)測定7種腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量，其中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括多巴胺（DA）、腎上腺素（E）、去甲腎上腺素（NE）和 5-羥色胺（5-HT），膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)主要是乙酰膽堿（Ach），

氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)包括興奮性氨基酸（谷氨酸 Glu）和抑制性氨基酸（氨基丁酸，

GABA）。

3 評價(jià)結(jié)果

（1） 行為學(xué)結(jié)果

① 慢性束縛應(yīng)激對水迷宮實(shí)驗(yàn)（空間探索階段）的影響

②慢性束縛應(yīng)激對水迷宮實(shí)驗(yàn)（工作記憶階段）的影響

③慢性束縛應(yīng)激對新物體識別的影響

此外，本課題組還針對Wistar大鼠的慢性束縛應(yīng)激（6h和10h/28天）誘導(dǎo)的認(rèn)知損傷進(jìn)行探究，行為學(xué)檢測主要包括獎(jiǎng)勵(lì)性操作條件反射，結(jié)果如下所示：

① 慢性束縛應(yīng)激對大鼠的興趣及運(yùn)動(dòng)能力的影響

各組別的運(yùn)動(dòng)路程及平均速度均沒有明顯變化，這同樣說明了慢性束縛應(yīng)激對大鼠的運(yùn)動(dòng)能力和探索興趣也沒顯著性影響。行為學(xué)檢測結(jié)束后，我們進(jìn)行了糖水?dāng)z取實(shí)驗(yàn)，即給予動(dòng)物 20%蔗糖水，自由飲水 1 h，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看到三個(gè)組別的糖水消耗量沒有明顯的變化。此結(jié)果再次驗(yàn)證了上述結(jié)論。

① 慢性束縛應(yīng)激損害大鼠獎(jiǎng)勵(lì)性操作條件反射學(xué)習(xí)能力

慢性束縛大鼠的踏板次數(shù)、鼻觸次數(shù)顯著性低于對照組。但隨著訓(xùn)練周期的延長大鼠的踏板次數(shù)逐漸的升高，并在訓(xùn)練第8天與對照組無明顯的差異，因此也致使大鼠的學(xué)習(xí)效率（LP/NP）呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，同樣在第 8天基本達(dá)到正常水平。以上結(jié)果說明了慢性束縛應(yīng)激阻礙了大鼠的學(xué)習(xí)能力，隨著訓(xùn)練強(qiáng)度的加大可以彌補(bǔ)這種損害作用。

③慢性束縛應(yīng)激對大鼠獎(jiǎng)勵(lì)性操作條件反射記憶鞏固的影響

④慢性束縛應(yīng)激對大鼠的復(fù)雜操作能力的影響

本實(shí)驗(yàn)采用的連續(xù)多次踏板操作來檢測大鼠的復(fù)雜操作能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8。結(jié)果顯示，在固定比率2和4階段，各項(xiàng)指標(biāo)均出現(xiàn)顯著性的差異。在 FR=2 階段，與對照組比較，束縛 6-h 組的踏板次數(shù)、鼻觸次數(shù)指標(biāo)首先出現(xiàn)顯著性差異（day 1）；反應(yīng)動(dòng)物踏板操作準(zhǔn)確性的指標(biāo)如 R/NP，R/LP，LP/NP等均在 day 2 出現(xiàn)顯著性差異。束縛 10-h 組表現(xiàn)出與束縛 6-h 相似的作用。FR=4階段，與對照組比較，束縛 6-h 組的踏板次數(shù)、鼻觸次數(shù)、獎(jiǎng)賞次數(shù)以及比率（R/NP，R/LP，LP/NP）均表現(xiàn)出顯著性的差異；束縛 10-h 組則在鼻觸次數(shù)（day 2，day3）、R/LP（day 2，day 3）、潛伏期（day 2）出現(xiàn)顯著性差異。從下圖同樣可以看出，隨著訓(xùn)練周期的增加，動(dòng)物的踏板次數(shù)、獎(jiǎng)賞次數(shù)以及操作任務(wù)的準(zhǔn)確性均在逐漸的升高。綜上所述，慢性束縛應(yīng)激可以損害大鼠復(fù)雜操作能力，但這種損害作用可以通過大量的操作任務(wù)訓(xùn)練來彌補(bǔ)。

圖 8. 慢性束縛應(yīng)激對大鼠的復(fù)雜操作能力的影響 (n=7-10，Mean±SEM）。與對照組比

較，*p<0.05，**p<0.01, ***p<0.001有顯著性差異。

（2）蛋白含量檢測結(jié)果

如圖9所示，慢性束縛應(yīng)激（6 h/day, 10 h/day）顯著性的減少皮層中糖皮質(zhì)激素受體（GR）的表達(dá) (p<0.001)。

圖9. 慢性束縛應(yīng)激對大鼠前額皮層內(nèi)GR蛋白表達(dá)的影響（n=3, mean±SEM）。與對照組比較，***p<0.001。

如圖10所示，CRS 6-h和CRS 10-h 組別均顯著性的降低皮層中BDNF的表達(dá)(p=0.002)，BDNF特異性的受體TrkB的表達(dá)也顯著性降低(p<0.001)。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一員，與其高親和力受體TrkB結(jié)合引起下游MAPK信號級聯(lián)反應(yīng)在神經(jīng)細(xì)胞的生存、分化、維護(hù)生理功能以及認(rèn)知功能等方面起到重要作用。束縛應(yīng)激大鼠皮層中總Erk1/2沒有變化，但其磷酸化水平顯著性降低（p<0.001）。

圖10. 慢性束縛應(yīng)激對大鼠前額皮層內(nèi)BDNF/TrkB/Erk1/2通路蛋白表達(dá)的影響（n=3,mean±SEM）。與對照組比較，**p<0.01，***p<0.001。

如圖11，結(jié)果表明，應(yīng)激組動(dòng)物皮層內(nèi) Egr-1 蛋白表達(dá)明顯的低于 Con組別，差異顯著（p<0.001）。

圖 11. 慢性束縛應(yīng)激對大鼠前額皮層內(nèi) Egr-1 蛋白表達(dá)的影響（n=3, mean±SEM）。與對照組比較，***p<0.001。

如圖12顯示，與 Con 比較，大鼠經(jīng)歷 28 天的慢性束縛應(yīng)激后，皮層中Synapsin-1的表達(dá)顯著性的減少 (CRS 6-h, p<0.001; CRS 10-h, p<0.001)

圖 12. 慢性束縛應(yīng)激對大鼠前額皮層內(nèi) Synapsin-1 蛋白表達(dá)的影響（n=3, mean±SEM）。與對照組比較，***p<0.001。

（3）神經(jīng)遞質(zhì)檢測

如圖13，慢性束縛應(yīng)激 28days 后，大鼠皮層中Ach的含量沒有發(fā)生顯著性的變化（p>0.05）。慢性束縛應(yīng)激顯著性的升高皮層內(nèi)興奮性氨基酸（Glu）的含量，其中 CRS 10-h（p=0.002）較 CRS 6-h（p=0.02）升高較多，抑制性氨基酸（GABA）則沒有明顯的變化。慢性束縛應(yīng)激對 E 和 NE 無明顯影響，但可以顯著性降低 5-HT的含量，并顯著性升高 DA 含量。

圖 13. 慢性束縛應(yīng)激對膽堿類神經(jīng)遞質(zhì) Ach、Glu、GABA、DA、NE、E和5-HT含量的影響（n=6, mean ±SEM）

1 動(dòng)物：SPF級SD、Wistar大鼠和ICR小鼠

2 材料：行為限制器、醫(yī)用棉簽

3 儀器：無

4 模型誘導(dǎo)方法：

慢性束縛組大鼠每天早上9:00開始束縛，束縛強(qiáng)度為6h和10h，連續(xù)束縛 28天。束縛時(shí)將動(dòng)物放進(jìn)大鼠束縛器內(nèi)（直徑6.0 cm，長21.0 cm），用底座固定，保持大鼠四肢固定，不能自由轉(zhuǎn)身。束縛器頂部及四周有數(shù)個(gè)孔洞，以保持束縛器內(nèi)空氣流通，以防動(dòng)物窒息死亡。束縛期間，模型大鼠放在臨近的隔壁房間，正常組與束縛大鼠隔開，去除束縛后再放回原來的動(dòng)物籠中。

應(yīng)激是人類所處生活環(huán)境中普遍存在的一種外界因素[1,2]。現(xiàn)代快節(jié)奏的生活、高強(qiáng)度的工作及各種特因環(huán)境等應(yīng)激對機(jī)體造成嚴(yán)重的生理和心理上的改變，尤其是對認(rèn)知能力的改變已成為影響人類身心健康的主要因素之一[3]。束縛，是一種將動(dòng)物置于無法逃脫的應(yīng)激環(huán)境中，通過行為制動(dòng)的方式，模擬人類社會(huì)中無法避免的擁擠、壓力性空間等應(yīng)激因素，是目前建立單純心理應(yīng)激所致學(xué)習(xí)記憶等神經(jīng)精神疾病應(yīng)用最廣泛的造模方法之一[4]。

文獻(xiàn)中關(guān)于建立該模型所使用的大小鼠品系繁多。慢性束縛應(yīng)激動(dòng)物模型都采用常用的模式動(dòng)物, 如大鼠和小鼠。多選用封閉群 Sprague-Dawley、 Wistar大鼠、ICR小鼠、C57BL /6J小鼠等[5-9]。雄性多見。造模周期為14-48 d不等[10]，本研究在前期實(shí)驗(yàn)研究和文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，選用10h/28d慢性束縛應(yīng)激對Wistar和SD大鼠的學(xué)習(xí)記憶損傷進(jìn)行比較研究；另選用Wistar大鼠進(jìn)行慢性束縛應(yīng)激造模6h和10h/28d觀察對動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶損傷的影響。確定該模型誘導(dǎo)的認(rèn)知損傷模型為航天特因環(huán)境及現(xiàn)代人類長期處于狹小環(huán)境作業(yè)誘發(fā)的學(xué)習(xí)記憶障礙機(jī)理研究、防護(hù)和藥物研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

參考文獻(xiàn)：

[1] Bowman RE．Stress-induced changes in spatial memory aresexually differentiated and vary across the lifespan[J]. J Neuroendocrinol,2005, 17(8): 526-535．

[2] Staufenbiel SM, Penninx BW, Spijker AT, et al． Hair cortisol，stress exposure, and mental health in humans: a systematicreview[J]. Psychoneuroendocrinology, 2013，38(8):1220-1235．

[3] 王克柱. 基于獎(jiǎng)上操作的慢性束縛應(yīng)激所致大鼠認(rèn)知功能損傷及Rg1、Rb1防護(hù)作用防護(hù)[D]. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院. 2016: 1–151.

[4] 王逸，盧聰，宋廣青，陳怡西，武宏偉，王瓊，曲麗娜，李瑩輝，劉新民. 慢性束縛應(yīng)激對SD和Wistar大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J]. 中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2014, 22(2):41-44.

[5] Chunhung Chiu, Charngcherng Chyau , ChinchuChen, et al. Erinacine A-Enriched Hericium Erinaceus Mycelium ProducesAntidepressant-Like Effects through Modulating BDNF/PI3K/Akt /GSK-3β Signalingin Mice. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(341):1-12.

[6] McLaughlin KJ, Gomez JL, Baran SE, et al. Theeffects of chronic stress on hippocampal morphology and function: an evaluationof chronic restraint paradigms. Brain Research, 2007, 1161:56-64.

[7] Kecheng Zhou, Junbin Yin, Huanghui Wu, et al.Danggui-Shaoyao-San, a Traditional Chinese Medicine, Relieved Depression andCognitive Disorder Induced by Chronic Restraint Stress Involved in RegulatingDendritic Spines Remodeling[J]. 2017.

[8] Liming Dong, Yi Wang, Jingwei Lv. Memoryenhancement of fresh ginseng on deficits induced by chronic restraint stress inmice[J]. Nutritional Neuroscience, 2017.

[9] Kezhu Wang, Pan Xu, Cong Lu, et al,. Effects ofginsenoside Rg1 on learning and memory in a reward-directed instrumental conditioningtask in chronic restraint stressed rats. Phytotherapy Research. 2017, 31: 81–89.

[10] Tatyana Buynitsky, David I. Mostofsky.Restraint stress in biobehavioral research: Recent developments. Neuroscienceand Biobehavioral Reviews. 2009,33:1089-1098.