根據 Hazenberg 等[7]、 Che 等[8]的研究結果,在接種人腸道菌群 2 周后,HFA 動物腸道內菌群結構豐度與志愿者菌群幾乎完全一致, 并且至少保持 5周穩定不變。 所以本研究選擇在灌胃接種志愿者糞便菌懸液 6 周和 10 周后,收集 CON 組和 CAD 組小鼠的新鮮糞便、 血液、 組織樣品進行檢測。 通過對腸道菌群 β-多樣性進行分析,CON 組小鼠與健康志愿者分布在同一象限、CAD 組小鼠與冠心病患者分布在同一象限,而健康志愿者及接種了健康志愿者腸道菌群的小鼠與冠心病患者及接種了患者菌群的小鼠分布在不同區域,且 Weighted Unifrac 距離差異有顯著性。α-多樣性分析結果，CAD組的Shannon 指數在兩個時間點均降低, Simpson 指數均升高，ACE 和 Chao1 指數在造模后 6 周和 10 周兩個時間點的數值均降低, 與 CON 組比較差異有顯著性。表明志愿者腸道菌群在無菌小鼠體內成功定植，并可形成復雜且與志愿者菌群相似的微生物區系，且CON 組、CAD 組小鼠腸道菌群結構與豐度差異顯著。

血脂是動脈血管壁發生病變的基礎物質，高血脂既是冠心病的獨立危險因素，也是其病理表現，其機理可能與心肌受損后泵血功能下降導致的血液流變學改變相關[9-11]。Fu 等[ 12]的研究發現厚壁菌門和擬桿菌門的豐度與體質量指數、 甘油水平、高密度脂蛋白水平呈有相關性。 Velagapudi 等[13]通過動物實驗證實腸道菌群可影響小鼠的能量代謝和血脂水平。 我們的實驗中,2 名冠心病志愿者的體質量指數、血脂均高于正常值。 糞菌液接種到無菌小鼠腸道后,CAD 組動物體重在移植后 5 周上升幅度增加, 小鼠血清中的 TG、 TC、 LDL-C 與 CON比較顯著升高。厚壁菌門和擬桿菌門是 CON 組與CAD 組腸道菌群中豐度差異最大的兩個門,結果與已有的研究報道相符。動脈粥樣硬化是一個慢性的炎癥發展過程[ 14]，其機制目前較為認同的是損傷反應學說及在此基礎上發展出的炎癥學說,在這個過程里始終存在各種炎癥細胞和大量炎癥介質參與[15-16]。 IL-6 作為心臟不良事件的獨立危險因素標志物參與易損斑塊的炎癥全程[17]。IL-10 的作用主要是在免疫應答進行負調節，它可以通過直接抑制免疫細胞的功能實現免疫抑制[ 18]，也可以通過控制 IL-1β 產生的炎癥反應避免組織過度損傷[19]。 IL-2 與 IL-2 受體 α亞基結合后可調節 T 淋巴細胞的活化, 而活化的 T淋巴細胞能分泌趨化因子增強炎癥反應,從而促進動脈粥樣硬化斑塊的形成及進展[20]。 實驗結果顯示,移植冠心病患者的腸道菌群后,小鼠血清中 IL-6,IL-2 升高, IL-10 降低而被 IL-10 調節的 IL-1β 升高,驗證了上述研究結果。 IL-4 參與粥樣硬化的機制比較復雜,目前尚無定論。 我們的結果顯示移植6 周時 IL-4 已經升高但無顯著性差異,10 周時顯著升高,說明 IL-4 參與的體液免疫可能促進動脈粥樣硬化的發展。上述實驗結果證明移植冠心病患者腸道菌群10 周后 HFA 小鼠的心肌細胞和血管內皮細胞已發生功能上的損傷, 導致血脂、 細胞因子的含量發生變化。 但由于斑塊形成是一個復雜且緩慢的過程,移植 10 周時心肌細胞和血管內皮細胞還未發生器質性改變,故 HE 染色中未發現泡沫細胞浸潤等斑塊形成的病理學變化。

理想的動物模型應具備以下特點:發病過程和機制盡量接近臨床情況;能夠對相關藥物或治療手段作出客觀評價;模型的制備應操作簡便、經濟、可重復性高[21]。本研究利用糞菌移植方法建立了冠心病 HFA 小鼠模型,除腸道菌群的結構與豐度與人類似外,體重、血脂、細胞因子含量也出現了與臨床類似的改變,為研究腸道菌群與冠心病關系研究提供了更多可選擇的動物模型。

模型制備過程中涉及健康志愿者和冠心病人糞便，無高致病性病原微生物，且使用后的糞便都進行了無害化處理，因此無生物安全隱患。

2. 1 動物一般情況

在整個動物實驗過程中，模型組和對照組動物小鼠精神良好、毛色光滑、攝食飲水正常，體重平穩增長。從第 5 周開始，CAD 組動物體重增長加快，與 CON 組比較差異有顯著性( P< 0. 05) ( 圖 1) 。

圖 1 體重變化

2. 2 腸道菌群 16S rDNA 檢測結果

2. 2. 1 腸道菌群多樣性分析

根據 OTUs 代表序列與數據庫注釋文件對比，在 97%(種) 水平上進行 OTUs 劃分，組在造模后 6 周和 10 周時所獲得的 OTUs 數均減少，與 CON組比較差異有顯著性( P < 0. 05 )。 Shannon 指數大、Simpson 指數小表示腸道菌群的多樣性強，CAD 組的 Shannon 指數在造模后兩個時間點均降低 ( P <0. 05，P < 0. 01 )， Simpson 指數均升高( P < 0. 05，P <0. 01)，與 CON 組比較差異有顯著性。ACE 和Chao1 指數大表示菌群豐度高, CAD 組的 ACE 和Chao1 指數在造模后兩個時間點的數值均降低( P <0. 05) ,與 CON 組比較差異有顯著性( 表 2)。

2. 2. 2 腸道菌群在門和屬水平上的構成

在造模 6 周和 10 周兩個時間點 CON 組 reads主要分布在以下 8 個門: 厚壁菌門( Firmicutes )、變形菌門( Proteobacteria)、擬桿菌門( Bacteroidetes )、疣微菌門( Verrucomicrobia )、 梭桿菌門( Fusobacteria )、放 線 菌 門 ( Actinobacteria )、 藍 藻 菌 門( Cyanobacteria)、軟壁菌門( Tenericutes)。

造模 6 周時，CAD 組厚壁菌門、軟壁菌門豐度降低( P<0. 05) ,與對照組比較差異有顯著性。擬桿菌門、疣微菌門豐度升高( P < 0. 01) ,與對照組比較差異有顯著性。造模 10 周時，CAD 組厚壁菌門豐度降低( P<0. 01)，與對照組比較差異有顯著性。擬桿菌門、疣微菌門豐度升高( P < 0. 01) ,與對照組比較差異有顯著性( 圖 2)。在屬水平，對相對豐度較高的菌株進行分析，造模 6 周時擬桿菌屬 ( Bacteroides )、 Akkermansia 菌屬相對豐度增高( P < 0. 01 )，Blautia 菌屬、Parasutterella 菌屬相對豐度降低 ( P < 0. 05, P <0. 01) ,與對照組比較差異有顯著性。造模 10 周時擬桿菌屬 ( Bacteroides )、 Akkermansia 菌屬相對豐度增高( P<0. 01)，腸桿菌屬( Lactobacillus )、 Blautia 菌屬、Parasutterella 菌屬相對豐度降低 ( P < 0. 05, P <0. 01)，與對照組比較差異有顯著性( 圖 3) 。

2. 2. 3 β-多樣性分析

β-多樣性研究是使用 Weighted Unifrac 距離來衡量組間相異系數,此系數越大表示組間物種多樣性的差異越大。 分析結果顯示，CAD組在建模 6周、10 周時的 Weighted Unifrac 距離分別為 0. 658、0. 681。 表明CAD 組與 CON 組在微生物物種構成方面存在顯著性差異( P<0. 05) ,差異有統計學意義( 圖 4A)。 CAD 組、CON 組的腸型分布在不同區域，同一組的不同階段則分布在相同區域( 圖 4B)。

2. 3 血液學指標

CAD 組小鼠在建模 6 周和 10 周時，血液中 TG ( P < 0. 05, P < 0. 01, 圖 5A)， TC ( P < 0. 05, 圖 5B )，LDH( P<0. 01,P<0. 0001,圖 5E) 和 CK( P<0. 01,P<0. 05,圖 5F) 值均升高，與 CON 組比較差異有顯著性。 LDL-C 在建模 6 周時升高( P < 0. 05 ) , 與 CON組比較差異有顯著性，10 周時未見差異有顯著性( 圖 5D)。 HDL-C 在兩個時間點均未見差異有顯著性( 圖 5C) 。

2. 4 細胞因子檢測

結果顯示，與斑塊形成、進展相關的細胞因子中，IL-6 在建模 6 周時濃度升高( P < 0. 05 )，10 周時減低( P < 0. 0001 ,圖 6 A)；IL-10 在建模 10 周時濃度降低 ( P < 0. 05 , 圖 6 E )；IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-1β 在建模 10 周時濃度升高 ( P < 0. 0001 , P <0. 05 ,P < 0. 0001 , P < 0. 01 , 圖 6 B, C, D, F )，與CON 組比較差異有統計學意義。IL-12 p70、TNF-α、INF-γ 在建模6周和10周時差異均無統計學意義( 圖 6 G,H,I) 。

2. 5 心臟組織病理學

在建模6周( 圖 7A,B)和10周( 圖 7C, D)時，CON組及CAD組小鼠胸主動脈無斑塊形成，血管內膜平滑，未見斷裂增厚，內皮細胞排列整齊，中膜厚度正常，平滑肌細胞排列整齊，均未見泡沫細胞形成等動脈粥樣硬化改變。

1. 1 材料

1. 1. 1 實驗動物

本實驗室自己繁育的無菌雌性 C57BL / 6J 小鼠28 只, 飼養于專用無菌隔離器，設施合格證號:【SYXK ( 京 ) 2018 - 0019】。飼養環境：溫度 21~25℃，濕度40% ~ 70%，光照周期明暗比 12 h:12 h。動物自由攝入經 50 kGy60Coγ 射線輻照消毒的定制無菌小鼠飼料。實驗中使用的飲水、墊料、鼠盒、水瓶、灌胃針等均經過 126℃ ,30 min 的高溫高壓滅菌處理。本實驗已獲得中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會( IACUC )批準，批準號:ZH17001。

1. 1. 2 試劑與儀器

抗體芯片檢測試劑：儀器校準試劑盒 Bio-Plex Validation Kit ( Bio-Rad )；Bio-Plex Calibration Kit。( Bio-Rad ) 。檢測試劑盒 Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Grp ⅠPanel 23-plex ( 貨號 M60009RDPD)。

主要儀器：懸液微珠芯片平臺，Bio-Plex MAGPIX System ( Bio-Rad)。組織脫水機、石蠟包埋機、石蠟切片機(德國Leica)、IQ5PCR儀 (美國Bio-Rad公司)。

1. 2方法

1. 2. 1志愿者信息

采集 2 位冠心病患者、1 位健康志愿者的新鮮糞便用于建立 HFA 模型( 表 1 ) 。 冠心病及健康志愿者均來自北京,為典型非素食中國飲食,體檢、血相正常;健康志愿者及冠心病患者的消化系統無其它器質性疾病;消化道未進行過手術;無酗酒史、糖尿病及其它影響腸道菌群的問題;取樣前 8 周未服用處方藥、益生菌、抗生素、非甾體類藥物。冠心病患者符合世界衛生組織/國際心臟病學會制定的冠心病診斷標準。

1. 2. 2 模型建立

8 周齡雌性無菌 C57BL / 6J 28 只，分為健康對照組( CON) 與冠心病( CAD) 組,每組 14 只。收集 3位志愿者清晨第 1 次排出的新鮮糞便，無菌、厭氧條件下稱量 1 g 加入 100 mL 0. 1 mol / L PBS ( pH 7. 2)緩沖液，振蕩混勻，制成糞便菌懸液待用。分別向2組的每只無菌小鼠體內經口灌喂 0. 4 mL 糞便懸液，建立冠心病人源菌群動物模型。

1. 3 檢測指標

動物每周稱體重, 在糞菌移植 6 周、10 周后每組分別安樂 7 只動物,進行以下指標的檢測:

1. 3. 1 腸道菌群16S rDNA 的檢測

動物安樂死前在隔離器內采集糞便，- 80℃ 冰箱冷凍保存。按參考文獻的方法進行基 因組DNA 提取和 PCR 擴增文庫構建、測序及生物信息學分析。

1. 3. 2 血液學指標:

動物用舒泰( 25 mg / kg) 麻醉后腹主動脈取血，取血結束剪斷腹主動脈放血將動物安樂死。血液3000 r / min 離心 10 min 取上清,樣品送北京中同藍博臨床檢測有限公司，采用比色法進行TG、TC、LDL-C、高密度脂蛋白( HDL-C)、LDH、CK的檢測。

1. 3. 3 細胞因子檢測

血液用 10 000 r / min 離心 10 min, 取上清。使用 Luminex 抗體芯片技術檢測血清中與粥樣硬化斑塊形成 相 關 的 細 胞 因 子: IL-1β、IL-2 、IL-4、IL-5、IL-6、INF-γ、IL-10 、IL-12 p7 0 、TNF-α 的濃度變化。

1. 3. 4 組織病理學

動物安樂死后，打開胸腔,取出心臟,自升主動脈處將心臟與主動脈分離并切除心臟的下半部分，用 PBS 洗凈殘血后 4% 中性甲醛固定進行 HE染色。

1. 4 統計學分析

所有實驗數據均采用平均值±標準差( ???x ± s) 表示，SPSS 22. 0 軟件進行差異顯著性分析，組間比較使用 t 檢驗，以 P< 0. 05 為差異有顯著性。

一、疾病概述

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病，是一種非常常見的心血管疾病。截止到 2016 年的數據顯示，我國城鄉居民因冠心病死亡 173. 6 萬例。冠心病是一種遺傳因素與環境因素共同作用導致的慢性復雜性疾病。在遺傳因素方面，有文獻報道通過全基因組關聯研究發現了 46 個與冠心病相關的危險基因，占冠心病遺傳因素的 10. 6%, 并且這些因素只與脂質和血壓相關且穩定性高，不易受飲食、性別、年齡和藥物的影響，從而使危險基因較難成為預防治療冠心病的靶點。

二、研究背景

1、實驗志愿者信息

采集冠心病人和健康志愿者糞便

2、實驗動物背景信息

無菌雌性 C57BL / 6J 小鼠

3、研究背景

腸道菌群作為環境因素的重要組成部分越來越受到研究者重視。直接利用人進行腸道菌群研究存在倫理學限制，動物模型是研究腸道菌群與宿主健康與疾病關系是必不可少的手段。由于實驗動物腸道菌群組成及代謝活性與人存在顯著差異，因此將動物體內實驗結果外推到人不是完全可靠的。以無菌( germ free mice, GF) 小鼠為研究對象通過糞菌移植方式建立人源菌群( human flora-associated, HFA) 動物模型，其微生物背景清晰，可有效控制遺傳基因、腸道微生物、飲食、性別年齡等因素造成的混雜性偏倚（Turnbaughet al. 2009;Faithet al. 2010）。本研究通過灌胃方式給無菌小鼠接種冠心病患者的新鮮糞便懸液建立冠心病HFA 動物模型，為探索腸道菌群在冠心病發生發展過程中的作用機制提供研究基礎。

Turnbaugh PJ, Ridaura VK, Faith JJ, et al. The effect of diet on the human gut microbiome: ametagenomic analysis in humanized gnotobiotic mice [J] . Sci Transl Med, 2009, 1( 6): 6ra14.

Faith JJ, Rey FE, O ’ Donnell D, et al. Creating and characterizing communities of human gut

microbes in gnotobiotic mice [J] . ISME J, 2010, 4( 9) : 1094- 1098.