目前沒有確證 有效的陽(yáng)性藥物，本單位用細(xì)胞模型從市售成藥中篩選有效藥物，發(fā)現(xiàn) PHD1（藥品代號(hào)）可以在細(xì)胞水平抑制病毒復(fù)制，隨后用小鼠模型進(jìn)行了藥效學(xué)評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)藥物治療感染小鼠后，臨床癥狀得到改善，病毒復(fù)制被顯著抑制，肺組織病理明顯改善，證明該藥物可治療感染小鼠。

1. 本實(shí)驗(yàn)所用的SARS-CoV-2病毒，在研究所已完成風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，具有完整的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，全部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)活動(dòng)在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

2. 本次申報(bào)的新資源“新型冠狀病毒再感染恒河猴模型”在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵守研究所生物安全規(guī)章制度和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)章制度，遵循SARS-CoV-2病毒風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和標(biāo)準(zhǔn)操作程序。

3. 感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的開展獲得IACUC委員會(huì)批準(zhǔn)（IACUC號(hào)：BLL20001-8）。

1、臨床指征變化情況：

在整個(gè)感染過(guò)程中，對(duì)體重、體溫等臨床特征進(jìn)行觀察。如圖2A所示，第一次SARS-CoV-2感染后，超過(guò)50%的猴子（4/7，M0、M1、M2和M4）的體重減輕了200至400克，然而所有猴子的直腸溫度均未升高（0/7）。在感染后15天左右，感染猴的體重（M2~ M6）逐漸增加到正常范圍（4/5，M4除外，圖2A），直腸溫度維持在正常范圍內(nèi)（圖2B）。初次感染后，除M4之外，其余6只感染猴觀察到短暫的食欲下降和/或呼吸頻率增加。

在感染后28天，再次感染SARS-CoV-2，猴子表現(xiàn)出短暫的體溫升高，這在初次感染期間是沒有觀察到的。

圖2 新冠病毒再感染恒河猴模型臨床指征的變化情況

2、病毒載量變化情況：

鼻拭子和咽拭子在感染后3天檢測(cè)到病毒載量峰值（6.5log10 RNA copies/mL），然后逐漸下降（圖3C和3D）。肛拭子的病毒載量峰值（5log10 RNA copies/mL）低于鼻拭子和咽拭子，也在感染后3天觀察到，然后呈線性下降，在感染后14天降至檢測(cè)限之下（圖3E）。在感染后15天左右，所有感染猴的鼻咽拭子和肛拭子的病毒載量均轉(zhuǎn)為陰性。

再次感染SARS-CoV-2后，在鼻咽和肛拭子中病毒載量在2周內(nèi)一直保持為陰性。

圖3 新冠病毒再感染恒河猴模型鼻/咽/肛拭子病毒載量的變化情況

3、血液學(xué)變化情況：

在所有接受初次攻毒的猴子中，白細(xì)胞計(jì)數(shù)（3.5–9.5× 109/L）、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（LYMP, 1.1–3.4 × 109/L）和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（NEUT,1.8–6.4 × 109/L）均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)。與基線相比，初次感染后感染猴的WBC和LYMP有輕微但顯著的降低（圖4F）。

再次感染SARS-CoV-2后，血液學(xué)檢測(cè)未觀察到顯著波動(dòng)。

圖4 新冠病毒再感染恒河猴模型血常規(guī)變化情況

4、影像學(xué)變化情況：

影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)雙側(cè)膈面模糊，肺部透明度降低，肺左下葉出現(xiàn)小斑影，提示感染猴出現(xiàn)肺炎，表現(xiàn)為中輕度至中度間質(zhì)炎性浸潤(rùn)。在28dpi時(shí)，胸部x光顯示肺部恢復(fù)正常（以M4、M6為代表，圖5G）。

再次感染后，M4、M6感染猴在33dpi（5dpr）影像學(xué)檢測(cè)未見異常（圖5G）。

圖5 新冠病毒再感染恒河猴模型影像學(xué)結(jié)果

5、組織分布及病理情況：

對(duì)感染猴進(jìn)行安樂取材，M0（5dpi）和M1（7dpi）中檢測(cè)到病毒RNA拷貝，主要集中在鼻（106–108 copies/mL）、咽部（104–106 copies/mL）、肺（103–107 copies/mL）和腸道（104–106 copies/mL）（圖6A）。肺組織進(jìn)行蘇木精和伊紅（H&E）染色，顯示出輕度至中度間質(zhì)性肺炎，表現(xiàn)為肺泡間隔增寬，肺泡間質(zhì)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增多，肺泡上皮變性。此外，初次感染后的猴子肺部發(fā)現(xiàn)了浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞。通過(guò)改良的馬松染色， M0（5dpi）和M1（7dpi）感染猴增厚的肺泡間質(zhì)中也可以觀察到膠原纖維（圖6B）。免疫組化發(fā)現(xiàn)病毒主要分布在肺泡上皮和巨噬細(xì)胞中（圖6C），證實(shí)了SARS-CoV-2導(dǎo)致恒河猴COVID-19。

M3（5dpr）和M5（5dpr）在二次感染后未在組織中檢測(cè)到病毒（圖6A），同時(shí)肺部病理檢查未見顯著的病變及免疫細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)。

圖6新冠病毒再感染恒河猴模型病毒分布和病理變化的比較

6、免疫細(xì)胞變化情況：

從外周血中檢測(cè)T和B淋巴細(xì)胞的亞群,包括CD4 + T細(xì)胞亞群（CD4+ T na?ve、CD4+ Tcm、CD4+ Tem）,CD8 + T細(xì)胞亞群（CD8+ T na?ve、CD8+ Tcm、CD8+ Tem），記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞。這些細(xì)胞在初次感染及再次感染后均保持穩(wěn)定階段。然而，與0dpi相比，在14dpi時(shí)觀察到外周血中活化的CD8+ T細(xì)胞的百分比增加，同時(shí)在再次感染后（0dpr）也發(fā)現(xiàn)了這一點(diǎn)（圖7A）。對(duì)淋巴結(jié)中的免疫細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，再次感染后5天后淋巴結(jié)CD4+ Tcm細(xì)胞百分比較初次感染后5天高，CD4+ T na?ve細(xì)胞和記憶B細(xì)胞百分比下降(圖7B)。

圖7新冠病毒再感染恒河猴模型免疫細(xì)胞的變化情況

7、抗體檢測(cè)：

由于抗SARS-CoV-2特異性抗體水平逐漸升高，21 dpi時(shí)的抗體滴度明顯高于3 dpi時(shí)，42 dpi（14 dpr）高于28 dpi（0 dpr）的抗體滴度（圖8C）。此外，特異性抗體滴度在14dpr時(shí)遠(yuǎn)高于14dpi時(shí)（圖8C，右側(cè)）。重要的是，如圖4D所示，中和抗體的平均滴度在再次感染后呈線性增強(qiáng)。

圖8新冠病毒再感染恒河猴模型抗體的變化情況

1、 實(shí)驗(yàn)材料：SARS-CoV-2病毒；選用體重4-6kg的SPF恒河猴。實(shí)驗(yàn)前體檢無(wú)異常，所有感染動(dòng)物必須在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

2、 氣管途徑SARS-CoV-2再感染恒河猴模型制作方法：每只動(dòng)物經(jīng)氣管途徑給予1毫升體積，106 TCID50 SARS-CoV-2病毒。待確定動(dòng)物初次感染建立成功后，持續(xù)監(jiān)測(cè)病毒載量和疾病表型，在所有動(dòng)物疾病恢復(fù)后，即初次感染后28天，再次經(jīng)氣管途徑給予1毫升體積，106 TCID50 SARS-CoV-2病毒，創(chuàng)建新冠病毒再感染恒河猴模型。

3、 樣本收集和檢測(cè)：按照以下實(shí)驗(yàn)方案對(duì)動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)和樣本采集，記錄體重、體溫、臨床體征；采集鼻/咽/肛拭子，測(cè)定病毒RNA；采集外周血，檢測(cè)血液學(xué)和免疫細(xì)胞變化；胸片觀察肺部病變情況；采集血清，進(jìn)行特異性抗體檢測(cè)，并在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行安樂死和尸檢，檢測(cè)病毒組織分布及病理改變。

一、疾病概述

2019冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19），是由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起，以重癥肺炎、呼吸衰竭為特征的傳染性疾病。SARS-CoV-2病毒傳染性強(qiáng)，自2019年12月在中國(guó)武漢出現(xiàn)后，快速在傳播，引發(fā)大流行。截至2020年11月17日，SARS-CoV-2累計(jì)確診感染人數(shù)超5542萬(wàn)，現(xiàn)有確診人數(shù)超過(guò)1580萬(wàn)人，因COVID-19死亡達(dá)133萬(wàn)人。我國(guó)累計(jì)報(bào)告確診病例92482例，死亡4749例。新型冠狀病毒的傳播嚴(yán)重影響了人們的正常生活，已成為關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會(huì)熱點(diǎn)問(wèn)題，新型冠狀病毒肺炎的防控與治療也是目前研究的熱點(diǎn)。

二、模型背景

1、病原信息

本實(shí)驗(yàn)室分離獲得SARS-CoV-2/WH-09/human/2020/CHN。它具有高度復(fù)制能力，并且能經(jīng)呼吸道傳播，這些特性使它在研究新型冠狀病毒肺炎的傳播、發(fā)病機(jī)制及疫苗和藥物的快速研發(fā)方面具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

選用7只體重4-6kg的3-5歲的SPF恒河猴（Maccamulatta）。實(shí)驗(yàn)前體檢無(wú)異常，所有感染動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)必須在ABSL-3室中進(jìn)行。

3、研究背景

新冠肺炎經(jīng)過(guò)治療后，部分患者在出院時(shí)未檢出SARS-CoV-2，然而在后續(xù)檢測(cè)中出現(xiàn)核酸結(jié)果呈陽(yáng)性。最近，有研究表明在COVID-19發(fā)病后的10-15天內(nèi)能檢測(cè)到SARS-CoV-2特異性中和抗體(NAbs)，患者在最初感染痊愈后可能有復(fù)發(fā)或再感染的風(fēng)險(xiǎn)，這引起了全世界的關(guān)注。

那么，病人康復(fù)后是否會(huì)發(fā)生病毒復(fù)陽(yáng)？感染新型冠狀病毒后是否會(huì)產(chǎn)生特異的抗體？抗體能否保護(hù)機(jī)體免受再次感染？康復(fù)病人血清內(nèi)的病毒特異性抗體能否用于臨床治療？哪些指標(biāo)可以證明新疫苗的保護(hù)作用？為了回答這些問(wèn)題，我們建立了新冠病毒短期內(nèi)再感染的恒河猴模型。我們利用7只恒河猴進(jìn)行縱向觀察，在初次SARS-CoV-2感染恢復(fù)后，再利用同一毒株進(jìn)行再次攻毒。通過(guò)再次感染，觀察再感染動(dòng)物的病毒和免疫特征，以期對(duì)新冠肺炎的“復(fù)陽(yáng)”情況進(jìn)行研究，為疫苗接種、恢復(fù)期血清治療和疾病預(yù)后提供重要的參考信息。